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产品介绍

镍离子琼脂糖凝胶4FF/6FF亲和层析填料

镍离子琼脂糖凝胶4FF/6FF通过高强度基质上螯合的金属镍离子选择性结合多个连续组氨酸残基。本产品（镍离子琼脂糖凝胶4FF/6FF）具有高结合量和高稳定性，可用于含多聚组氨酸（通常是6个）标签重组蛋白的亲和层析纯化。
 

技术参数

基质：6%高交联的琼脂糖
配基：金属镍离子
颗粒大小：90 μm（平均）
吸附载量：不小于25 mg 测试蛋白（15kD）/mL柱料
最大流速：500 cm/h
最高耐压：0.3 MPa
pH稳定性：3~13（长时间）；2~14（短时间）
使用温度：常温
 

成分

镍离子琼脂糖凝胶4FF/6FF       20%乙醇溶液
 

使用方法

待纯化样品处理：
样品要充分溶解，避免出现堵塞现象，可以利用0.45μM滤膜过滤杂质。溶解样品的缓冲液最好与柱层析用的缓冲液一致，如20mM磷酸缓冲液或PBS（可以含有0.1M-0.5M NaCl）。
上柱前准备：
洗柱料：
1.轻柔震动以重悬介质
2.估计待纯化蛋白的总量，吸出足量柱料
3.低速离心2分钟或静置自然沉淀柱料
4.去除含乙醇上清
5.加入5倍体积去离子水，充分振荡，洗涤柱料，不要机械搅拌
6.再次低速离心2分钟或静置自然沉淀柱料
7.去除上清，用一倍体积上样缓冲液重悬柱料（如20mM Na2HPO4，0.5M NaCl，10mM咪唑，pH7.4）
装柱：
按照层析柱厂家说明书或其它参考手册将上述柱料装填在适当大小的层析柱中备用。
上样纯化：
1.上样：将含多聚组氨酸标签的蛋白粗样上样至装填好的层析柱中，控制流速不要太快，以保证良好的结合效果。同时收集流出液（流穿）待后续分析。
2.洗杂：用上样缓冲液或洗涤缓冲液清洗层析柱，以洗涤非特异结合的杂质，可以收集洗杂流出液待后续分析。
3.洗脱：两种方法
方法1.降低pH洗脱（一步或者分步），大部分蛋白溶解于pH4-6。可选择柠檬酸盐，磷酸或者乙酸盐为洗脱缓冲液。逐步或一步降低pH至4，收集洗脱流出液
方法2.逐步提高咪唑的浓度（0-0.5M），以上样缓冲液中加入不同浓度的咪唑溶液为洗脱液，分步洗脱结合的蛋白，收集洗脱流出液

再生： 分常规清洗和彻底再生
一般在每次做完层析纯化后进行常规清洗
1.含0.5M咪唑缓冲液洗柱5个体积
2.去离子水洗柱5个柱体积
3.1M-2M NaCl洗柱5个柱体积
4.去离子水洗柱5个柱体积
5.0.5M NaOH洗柱5个柱体积
6.去离子水洗柱5个柱体积
 
层析柱在使用多次，一般5次以后就可以进行一次彻底再生
1.洗脱完样品的层析柱用0.05M EDTA，0.5M NaCl来洗涤3个柱体积，以彻底脱去镍离子
2.用3个柱体积的0.5M NaCl来洗干净EDTA
3.用3倍柱体积2M NaCl，反向洗脱层析柱
4.用1M NaOH洗涤30分钟
5.用5倍柱体积70%乙醇洗涤层析柱，或者先用含0.1-0.5%非离子去垢剂的0.1M乙酸溶液洗涤30分钟，然后再用5个柱床的70％乙醇去除去垢剂
6.最后用去离子水将层析柱洗涤干净。
以上每一洗涤步骤之间也可以用3倍体积去离子水洗涤一次。

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