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待纯化样品处理：
样品要充分溶解，避免出现堵塞现象，可以利用0.45μM滤膜过滤杂质。溶解样品的缓冲液最好与柱层析用的缓冲液一致，如20mM磷酸缓冲液或PBS（可以含有0.1M-0.5M NaCl）。
上柱前准备
平衡预装柱：
1. 使用预装柱时，将AKTA纯化系统或中压纯化系统中的气泡排净，选择合适管路与之相连，保证预装柱内无气泡。用水流洗，以检查预装柱各连接处是否漏水。
2. 用不小于5倍柱料体积的去离子水冲洗预装柱，以彻底除去保存液中含有的乙醇
3. 用不小于5倍柱料体积的上样缓冲液平衡预装柱，至流出液pH值稳定达到上样缓冲液的pH值
上样纯化：
1.上样：将含多聚组氨酸标签的蛋白粗样上样至装填好的层析柱中，控制流速不要太快，以保证良好的结合效果。同时收集流出液（流穿）待后续分析。
2.洗杂：用上样缓冲液或洗涤缓冲液清洗层析柱，以洗涤非特异结合的杂质，可以收集洗杂流出液待后续分析。
3.洗脱：两种方法
方法1.降低pH洗脱（一步或者分步），大部分蛋白溶解于pH4-6。可选择柠檬酸盐，磷酸或者乙酸盐为洗脱缓冲液。逐步或一步降低pH至4，收集洗脱流出液
方法2.逐步提高咪唑的浓度（0-0.5M），以上样缓冲液中加入不同浓度的咪唑溶液为洗脱液，分步洗脱结合的蛋白，收集洗脱流出液
4.再生： 分常规清洗和彻底再生
a.一般在每次做完层析纯化后进行常规清洗
1.含0.5M咪唑缓冲液洗柱5个体积
2.去离子水洗柱5个柱体积
3.1M-2M NaCl洗柱5个柱体积
4.去离子水洗柱5个柱体积
5.0.5M NaOH洗柱5个柱体积
6.去离子水洗柱5个柱体积
b.层析柱在使用多次，一般5次以后就可以进行一次彻底再生
1.洗脱完样品的层析柱用0.05M EDTA，0.5M NaCl来洗涤3个柱体积，以彻底脱去镍离子
2.用3个柱体积的0.5M NaCl来洗干净EDTA
3.用3倍柱体积2M NaCl，反向洗脱层析柱
4.用1M NaOH洗涤30分钟
5.用5倍柱体积70%乙醇洗涤层析柱，或者先用含0.1-0.5%非离子去垢剂的0.1M乙酸溶液洗涤30分钟，然后再用5个柱床的70％乙醇去除去垢剂
6.最后用去离子水将层析柱洗涤干净。(以上每一洗涤步骤之间也可以用3倍体积去离子水洗涤一次)
c.使用预装柱时，为了避免死体积太大，可将预装柱中上层保护液吸出，留一厘米左后的液体，将AKTA纯化系统或中压纯化系统中的气泡排净，选择合适管路与之相连，保证预装柱内无气泡。装好之后，先用纯化水洗5~10个柱体积，再用缓冲液平衡5~10个柱体积，具体洗涤步骤按实际要求选择。
 

常见问题
1.样品不挂柱
----如果发现目的蛋白不挂柱，而是出现在上样流穿液中，应先验证表达的目的蛋白是否含有多聚组氨酸标签；
----检查pH和缓冲液成分，升高pH可提高结合能力，避免溶液中有EDTA加入；
----检查上样缓冲液中咪唑浓度是否过高，咪唑浓度一般不要超过10mM。
2.洗脱液中不含目的蛋白或者含量很低
----电泳检查目的蛋白表达量，看看目的蛋白表达量是否过低，如果是的话，通过优化条件或更换表达体系提高表达量；
----也可能是柱体积相对过大或上样量太少，可加大上样量；
----观察目的蛋白是否有降解，如果有可以加蛋白酶抑制剂。
3.洗脱产物中有多条杂带
----杂蛋白也可能含有与Ni离子结合的氨基酸残基，如组氨酸、半胱氨酸等，但这些结合都比多聚组氨酸（如His6）的结合弱，用咪唑浓度梯度或者pH值梯度洗脱有可能将不同结合强度的蛋白分别洗脱下来，从而达到分离目的蛋白和杂蛋白的目标；
----另外，镍离子螯合亲和层析填料具有较强的离子效应，在整个纯化溶液体系中加入100mM-500mM NaCl可以起到很好的降低因离子效应导致的非特异结合的问题，使得结合的目的蛋白纯度更高；
----杂蛋白与目的蛋白之间还有可能会通过疏水相互作用的结合在一起，共同挂在层析柱料上，这种情况下，可以在缓冲液加入去垢剂（如1%-2％Triton X-100或者2％Tween 20）等以解离杂蛋白与目的蛋白的结合。
4.包涵体表达样品如何纯化
----如果目的蛋白以包涵体形式表达，可以使用6M盐酸胍或者8 M尿素溶解变性包涵体，然后再进行纯化。
5.样品太粘稠
----主要原因是破菌不彻底导致大量核酸的存在，可以继续超声，或者加入适量核酸酶处理15分钟。
6.柱料变为棕色
----主要是指上样过程柱料由浅蓝色变为棕色，这是由于样品中还原剂浓度太高引起的，过高浓度的还原剂将二价镍离子还原为一价金属离子，从而使颜色发生改变。