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    利用原核系统进行重组蛋白的研发和生产是必拓生物的优势技术平台之一。必拓生物技术团队常年从事重组蛋白的开发工作，从基因序列优化、载体构建、培养和表达条件、菌种稳定性、蛋白复性条件、纯化工艺等多方面均拥有丰富的经验，可帮助客户进行检测用抗原、免疫用抗原、细胞因子、单链抗体、纳米抗体、信号通路蛋白、病毒样颗粒蛋白（VLP）等“从基因到蛋白”的一站式开发和制备工作，最终为客户提供毫克级、克级高纯度、高活性、低内毒素的高品质重组蛋白。必拓生物技术团队曾承担国家“863”计划“原核表达系统的研究及应用”等多项国家和北京市课题。公司每年承担客户200多种重组蛋白的定制工作。

基因设计及合成
    必拓生物为客户提供密码子、GC含量和特殊基因序列的优化等基因设计工作，能提高转录和翻译效率，提高mRNA稳定性。

载体构建
    必拓生物有如pET21a（+），pET28a(+)、pGEX系列、pMAL系列等常见通用载体，也有十多种自主优化构建的特色载体，这些载体分别具有提高表达量、促进分泌表达、促进可溶表达、促进二硫键形成等特征。必拓生物提供近四十种成熟原核表达载体供选择，并可针对目的蛋白性质、制备工艺要求以及大肠杆菌系统的特点，优化基因序列和载体构建，以求得到最优的表达系统等。在构建表达载体时必拓生物主要通过以下几方面进行优化：
1）启动子的选择，提供强启动子、中强启动子及弱启动子的选择；
2）信号肽的选择，提供多种不同分泌机制的信号肽供选择，找到最优的表达信号肽；
3）促表达伴侣分子的选择，有多种促可溶表达分子伴侣、促二硫键形成分子伴侣、促折叠分子伴侣可供选择；
4）纯化标签的选择，为方便纯化制备，提供多种亲和纯化标签供选择，如His6标签、GST标签、MBP标签、Strep标签等。

表达菌株建立、诱导表达条件优化及制备
    必拓生物拥有BL21(DE3)、BLR(DE3)、BL21(DE3) Star、Origami B(DE3)、C43(DE3)、Rosetta 2(DE3)、M15等十多种表达宿主菌可供选择，主要从增强质粒稳定性、提高表达量、促进含稀有密码子基因的表达、提供胞内蛋白二硫键形成环境、促进毒性蛋白表达等方面进行表达菌株的选择，并进行小量诱导表达和检测。必要时进行表达条件的优化。
    根据表达优化条件，可以为客户提供毫克级至百毫克级甚至克级蛋白的定制。
    必拓生物还可根据客户需求，为客户提供转化效率1×10 6 cfu/μg到>1×108 cfu/μg转化效率的化学感受态细胞定制。

重组蛋白大规模表达工艺优化
    必拓生物可以为客户提供3L、10L、50L、150L等不同量级的蛋白发酵工艺的优化，主要从培养方式、培养基、pH值、培养温度、发酵时间等多个角度入手，对重组蛋白的大规模表达工艺进行优化。

蛋白复性
    必拓生物综合现有各类复性方法，优化出若干类针对不同重组蛋白的方法，分别复性不同蛋白，达到使每种重组蛋白都获得较高复性效率的目的。这些优化的方面包括：
    a）缓冲体系的选择；
    b）盐离子种类和强度的选择；
    c）氧化还原对的选择，这个需要参考重组蛋白的二硫键含量情况；
    d）聚集抑制剂和复性促进剂的选择。有多种化学试剂可以用来抑制蛋白聚集和促进复性，复性重组蛋白时可以针对性选用。

蛋白纯化
    必拓生物建有完善的“层析介质研发和生产平台”，具备成熟的离子层析介质和亲和层析介质制备经验和产品，可以进行多样化的蛋白纯化方法选择和优化。必拓生物根据客户的实际需求，为客户制备出纯度达到90%-98%重组蛋白。公司拥有先进的AKTA purifier系统和全套离子层析及亲和层析介质预装柱，保障蛋白纯化工作的高效运行。

内毒素控制与去除
    原核系统表达的蛋白产品会夹带大量内毒素残留，其主要来源为大肠杆菌细胞壁成分脂多糖。内毒素因为其本身异质性，分子大小不一、疏水性很强、带很强负电荷，往往与目的蛋白结合在一起，极不易分开，所以去除起来很困难，迄今并无很好的方法。必拓生物通过全流程控制和针对性去除相结合的方法控制残留水平，最终将产品内毒素水平控制在小于1EU/μg甚至小于0.1EU/μg。

蛋白鉴定
    必拓生物熟练掌握SDS-PAGE、蛋白浓度检测、Western blot、流式细胞术等定性或者定量分析的方法进行重组蛋白鉴定。

GMP级蛋白定制
    必拓生物依托中科院的GMP级重组蛋白生产车间，拥有完备的发酵、纯化和冻干设备，为客户提供GMP级重组蛋白的定制。实验室配备3L\10L\150L\1000L\2000L等不同规格的发酵罐，并配备管式离心机、高速离心机、AKTA系列纯化设备和配套各种规格层析柱、冻干机等重组蛋白生产设备。必拓生物技术团队拥有多年按照GMP规范进行蛋白生产的经验，从原料、人员、设施设备、生产过程、包装运输和质量控制等方面严格按照国家法规要求进行管理，保障产品质量。

弘业新创抗体技术股份有限公司
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