来宝网 2015/6/25点击804次
自底物噬菌体显示技术出现以来,人们对此技术进行了很多完善和修改,并应用于实际之中。在最后,我们将对一些类似的系统进行综述,并描述其在解决一系列科研难题中的工用。
底物消减文库
这是一种改良的底物噬菌体技术,用于区别两种不同蛋白酶的底物特异性。首先的几轮筛选使用第一种蛋白酶筛选底物文库,将阳性底物分离出来。之后,又用第二个蛋白酶底物对此阳性底物进行筛选,分离得到非底物序列。结果,得到的序列能够被第一个酶水解,但是不能够被第二个蛋白酶水解。这种方法被用于区别纤溶酶原激活物t-PA和u—pA的特异性。尽管两种蛋白酶都可以切割在P2和P1位点上的同一种GR序列,但是通过这种方法发现u-PA优先切割P3位点的丝氨酸,而t-PA更偏向于切割体积较大的氨基酸,如酪氨酸和精氨酸。
肽段连接酶的底物特异性
多种底物噬菌体展示技术被用于阐明一个工程连接酶的底物特异性。一种其活性位点221位丝氨酸突变成半胱氨酸、225位脯氨酸突变成丙氨酸的枯草杆菌蛋白酶变异体,被发现可以将脂化的肽段连接到其他肽段或蛋白的N末端。通过将噬菌体展示的hGH前三个密码子随机化制备底物噬菌体文库,让它与枯草杆菌蛋白酶变异体在生物素连接的肽脂(亚氨基生物素—KGAAPF-甘油—F—酰氨)存在的情况下一起反应,用抗生物素蛋白的琼脂糖珠捕获而分离连接后的底物噬菌体。这样,文库中那些含有连接反应的良好亲核试剂的文库多肽就被选择性地富集。以此方法得到的结果与使用合成底物得到的结果符合得很好,尤其是在P1,位点上。
自出现开始,底物噬菌体展示技术就显示了其在探测底物活性中强大的作用。许多不同的实验室构建了一系列底物噬菌体展示载体,并用于测定许多酶(主要为蛋白酶和蛋白激酶)的底物序列。然而其应用前景比这些还广阔得多;很多肽段转录后的修饰也能应用于底物噬菌体展示的方法。最后,几个独创的应用噬菌体展示技术的新方法正在开始出现。这其中包括在更广意义上的探测酶与底物间相互作用的方法,在这种情况下,酶与底物都被展示于同一个噬菌体颗粒上。