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CAR-T治疗又称嵌合抗原受体T细胞治疗，是将人的T细胞经过基因工程手段体外修饰改造后，回输患者体内，用于治疗疾病。这是一个出现了很多年，但是近几年才被改良使用到临床上的新型细胞疗法。
2017年，FDA批准了2个CAR-T产品上市，开创了CAR-T疗法新纪元。Kymriah作为首个FDA批准的CAR-T药物，适应于急性淋巴细胞性白血病。10月18日， Yescarta作为第二个FDA批准的CAR-T药物，用于治疗成人复发或难性大B细胞淋巴瘤，同时也是第一个用于治疗非霍奇金淋巴瘤的CAR-T 产品。
目前生产CAR-T细胞疗法的主要步骤包括最初分离和富集T细胞、T细胞活化、使用病毒或非病毒载体系统进行CAR基因转移、体外CAR-T细胞扩增，CAR-T细胞质控以及最后的末端工艺和冷冻保存，整个制造周期一般需要2～4周。

 
图1.CAR-T生产的各个阶段和工艺方案示例1

CAR -T细胞治疗的一般流程
1.    分离及富集T细胞
生产CAR-T的第一步，是通过白细胞分离术从患者 （或同种异体的供体） 处收集外周血单核细胞 （PBMC） ；然后利用基于磁珠的技术分离出特定的T细胞亚群，如CD4+、CD8+、CD25+或CD62L+T细胞。
2.    T细胞活化

3.    CAR-T载体构建及包装
实现CAR在T细胞上的表达，是CAR-T生产的核心技术，这一步需要利用到载体将CAR基因导入T细胞。理想的载体应该具有较高的基因转染效率、稳定性好，不引起机体免疫反应等特点。
目前有多种方法用于T细胞修饰，包括病毒载体转导 （如γ-逆转录病毒、慢病毒载体等） 及非病毒载体转染 （转座子转染、电穿孔等技术等） 。其中慢病毒转导应用较为广泛。
用于将CAR转导进T细胞的LV载体，是CAR-T细胞生产过程中的关键原材料。LV规模化生产的产能、成本、质量等各方面都将直接影响着CAR-T产品最终的治疗应用。

图2.LV载体制备（图片来源：百度）

LV生产的上游工艺主要包括细胞培养 （分为悬浮/贴壁培养等） 和病毒包装；下游工艺一般涉及澄清、纯化、过滤、浓缩、除菌等步骤。与细胞分离步骤一样，载体的无菌性至关重要，因为最终的CAR-T细胞产物无法通过过滤进行灭菌。
EndoFree Plasmid Kits基于阴离子交换技术，将高效的内毒素去除步骤整合到质粒纯化流程中，不需要额外步骤，也不需用亲和柱去除脂多糖，可快速获得<0.1 EU/µg的质粒DNA。

图2.Oxford BioMedica为诺华Kymriah代工的慢病毒制造流程2

目前主要存在的挑战包括LV成本高、收率低、活性容易丧失等。LV生产成本高也是CAR-T定价持高不下的一个主要原因，因此，高成本效益的LV生产对于满足商业需求并平稳过渡到临床生产规模至关重要。
PEIpro ®产品系列是用于病毒载体生产的一款基于PEI的多功能转染试剂，于2012年上市，致力于大规模瞬时基因表达(TGE)的低成本病毒生产，从工艺开发到商业化生产保持一致的病毒产量，并且悬浮和贴壁体系均可获得极高的病毒产量，是细胞治疗领域转染试剂金标准。同时，PEIpro ®具有不同的的产品等级，具有专业的法规团队助力满足合规性要求，提供完全符合GMP要求的商品，按需可提供经验证的残留检测服务
 

4.    T细胞扩增
体外培养，大量扩增CAR-T细胞至治疗所需剂量，一般为十亿至百亿级别。

5.    CAR-T细胞质控
回输CAR-T细胞，严密监护病人，观察疗效并严密监测不良反应。

[1] Claire, Roddie, Maeve, et al. Manufacturing chimeric antigen receptor T cells: issues and challenges.[J]. Cytotherapy, 2019.
[2] Levine B L , Miskin J , Wonnacott K , et al. Global Manufacturing of CAR T Cell Therapy[J]. Molecular Therapy Methods & Clinical Development, 2017, 4(C):92-101.