调节性T细胞专辑（一）

来宝网 2016/5/26点击929次

关于调节性T细胞

不同的亚群，类似的功能调节性T细胞（Tregs）在维持机体免疫平衡方面具有非常重要的作用。Tregs通过抑制其他T细胞的功能而抑制免疫反应。一些自身免疫性疾病如多发性硬化症、活动性类风湿性关节炎、I型糖尿病等Tregs的数量和功能均会发生变化。在许多恶性疾病如肺、胰腺和乳腺癌等已经发现Tregs明显增高。Tregs也阻断抗肿瘤免疫反应从而导致死亡率上升。
CD4和CD8 Tregs
Tregs目前确定的两个主要类别为：CD4 Tregs和CD8 Tregs。
CD4 Tregs分为两类：
“天然”Tregs（n Tregs），其表达CD25和FoxP3；和适应性或者称为诱导性Tregs（iTregs）。天然Tregs源自胸腺的CD4⁺ 细胞，该细胞CD25强阳性并表达转录因子（和系标志）FoxP3。 n Tregs约占总CD4⁺ T细胞的5-10%, 并可以在T淋巴细胞发育的单阳性阶段首先出现，
由于具有与自身抗原的高亲和力而被阳性选择，该信号传递时通过T细胞受体和胸腺基质细胞上的带有自身抗原肽的MCH-II复合体相互作用传递。
Tregs属于细胞因子非依赖型。适应性或诱导性Tregs来源于胸腺CD4单阳性细胞，他们分化为CD25和FoxP3表达的Tregs（i Tregs）需要有足够的同源抗原和特异的免疫调节因子如TGF-β、IL-10及IL-4刺激。
FoxP3是目前Tregs最特异的标记，尽管有报道一小部分Tregs 中 FoxP3 阴性。转录因子FoxP3作为Tregs标志的发现使科学家们能够更好地确定Tregs细胞群并且发现包括CD127在内的其他的Tregs标志。

CD127的发现

从Barbara Fazekas de St. Groth（癌症医学与细胞生物学研究所，悉尼，澳大利亚）Jeffrey Bluestone（UCSF的糖尿病中心，旧金山，加州，美国）实验室的研究和BD生物科学实验室证据表明CD127在调节性T细胞的表达是下调的，与FoxP3的表达呈负相关。而且，调节性T细胞在表达高和低水平CD25的细胞群中也是以不同水平存在的。CD127的发现提供了Tregs的一个新的表面标记 ,从而可以通过流式细胞仪分选活的Tregs进一步进行下游分析。

CD127是异构IL-7受体的一部分，异构IL-7受体是由CD127和通用γ链组成，γ链在其他细胞因子受体（IL-2R、IL-4R、IL-9R、IL-15R和IL-21R）也存在。CD127表达于胸腺细胞、T和B祖细胞、成熟T细胞、单核细胞以及一些其他的淋巴细胞和骨骼细胞上。有研究显示IL-7R在成熟T细胞增殖和分化过程中其重要作用。体外实验表明，CD127的表达随着T细胞活化而下调， ^7-9 这是因为FoxP3与CD127启动子相互作用从而降低Tregs的CD127表达。

Treg 亚群

自然调节T细胞 (nTregs)

诱导调节T细胞 (iTregs)

nTregs

Tr1

Th3

显型

CD4+CD25^int/high, CD127^low

CD4⁺CD25^-

CD4⁺CD25⁺ from CD25^- precursors

其他辅助标记

CTLA4⁺, GITR⁺, FoxP3⁺, CD127^low

CD25^low-variable, CD45RB^low, FoxP3^-

CD25^low-variable, CD45RB^low, FoxP3⁺

抑制

Contact dependent, granzyme B-dependent, makes TGF-β

Through cytokines produces IL-10

Through cytokines, produces TGF-β

靶细胞

APC and T effector cells

T effector cells

Not yet Identified

包含CD28

Thymic development and maintenance in periphery

Not for development or function

Not involved

体内作用

Suppression of autoreactive T cells

Mucosal immunity, inflammatory response

体外扩增

Expandable using TCR/CD28 stimulation and IL-2

CD3, IL-10, rehnoic acid

CD3, TGF-β

调节性T细胞的鉴别

FoxP3：经典的Tregs标志

尽管已有多种标志可以用于Tregs的鉴别，但在FoxP3发现之前尚未有特异的Tregs标志。目前，FoxP3作为唯一的Tregs特异标志已经在Sakaguchi和Rudensky的研究中报道过。
FoxP3（也称Scurfin，IPEX和JM2）是转录因子forkhead或winged helix家族的转录抑制因子。 ¹³ 它在所有CD4⁺ Tregs中表达，并具有调节活性。FoxP3的突变与鼠遗传性自身免疫性皮屑疾病和人的IPEX疾病（免疫调节异常，多发内分泌疾病和肠病，X-染色体综合症）密切相关。 ¹⁴
FoxP3对于确定分选出的Tregs的纯度和产量，及鉴定确定的Tregs都非常有用。但是，它不适用于分离活的Tregs，因为FoxP3的染色必须要固定细胞并破膜，所以这CD127^-是更好的选择。

FoxP3染色
来自于BD生物科学的人FoxP3单克隆抗体（克隆259D/C7）与人FoxP3转录因子所有已鉴定过的亚型都能反应，并且也与猕猴、恒河猴和狒狒有交叉反应。
BD Pharmingen的人FoxP3抗体和缓冲液试剂盒是一种高效地用来检测FoxP3阳性Tregs的试剂盒。这种简单易行的缓冲液体系可以使研究者只用很少的步骤就能完成细胞固定和破膜。但如果用冻存样品的方法至少需72h。

支持新的目标标记列表
FoxP3是一种经常用于调节T细胞鉴定、分离和表征的标记物。但是，Tregs依然是目前研究的热点，并且文献中发表了新型目标标记物的列表.为了支持这些新的发现，BD Bioscience也不断地研发出新的高质量试剂和溶液。

CD39：增强Tregs的鉴别
以前研究发现CD39主要位于B细胞、树突细胞和某些T细胞亚型，现在的研究表明CD39与FoxP3共表达于人和小鼠的CD4⁺ Tregs。 ¹⁵ 这一发现也增加到Tregs不断增加的表面标记物列表中，列表中有诸如CD25、CD45RA、HLA-DR和CTLA-4等表面标记物，这些标记物对于CD4⁺ Tregs的识别和功能鉴定是至关重要的。
细胞外ATP和它的代谢产物是调节大部分细胞和器官功能的有效调节分子。细胞ATP释放的是组织破坏的标记和激活免疫系统的一种危险“信号”。CD39水解细胞外ATP（或者其他三磷酸苷）成为相应的核苷酸，如AMP等。细胞外的单磷酸核苷很好被可溶性或者膜结合的5’-外核酸酶（CD73）降解为核苷（如腺苷）。然后，细胞外周的腺苷介导抗炎症性的T细胞反应。CD39和CD73的共表达被认为是Tregs介导免疫抑制的一个关键机制。 ^16,17
BD Pharmingen的抗人CD39（Clone TÜ66）单克隆抗体是人Tregs的新型标记物，并且提供PE及APC标记的即用型流式细胞术试剂盒。TÜ66能够识别ENTPD1，ENTPD1是一种胞外酶，属于核苷三磷酸二磷酸酶类家族（ENTPDase）。该家族的成员参与胞外核苷酸的分解代谢，控制胞外核苷三磷酸的量（NTPs）。
CD152 (CTLA-4)
细胞毒性T淋巴细胞抗原4（CTLA-4或CD152）在对Tregs的抑制功能中是至关重要的。 ¹⁸ 在zheng等人的一项研究中，将CD152转染CD25^-FoxP3^-T细胞，得到具有抑制功能且并不表达FoxP3。 ¹⁹
其他研究组的研究也表明，阻断CD152也减弱Tregs细胞的抑制活性。CD152的异常表达在自身免疫疾病如风湿性关节炎等中也有一定作用。 ¹⁹
CD152在树突细胞中介导抑制活性是通过下调树突细胞CD80和CD86的表达，进而影响抗原呈递细胞激活其他T细胞的能力。 ²⁰
关于CD152的研究促进了我们对于Tregs功能的理解。已知的Tregs细胞类型，现有的标记物以及新兴的标记物将极大地促进Tregs研究的新发现。

已有报道的人类调节性T细胞标记
这份表格集锦了人类调节性T细胞研究的中最常用到的试剂。我们的试剂品种在不断扩展。敬请访问bdbiosciences.com/treg 来获得最新产品信息。

抗原	人类表型	参考文献编号
CCR4	positive	21, 22
CCR6	positive	22
CCR7	positive	23
CD4	positive	12, 24, 25
CD11a	high	26, 27
CD25	positive	28
CD39	positive and negative subsets	29
CD45RA	positive	30
CD45R0	positive	31
CD46	positive	10
CD54 (ICAM-1)	high
CD62L	low and high subsets	32
CD69	positive	33
CD103	positive	34
CD122 (IL-2Rβ)	positive
CD127	low	5, 6
CD134 (OX-40)	positive and negative subsets	35
CD152 (CTLA-4)	high	36, 37
CD154 (CD40L)	positive	38
CD223/LAG-3	positive	39, 40, 46
CXCR4	positive	33
CXCR5	positive	33
CXCR6	positive	33
FoxP3	positive	41, 42
GITR	high	43
GPR83	positive	44
Granzyme B	positive	45
IL-10	positive	46
IL-35	positive	47
MHCII	positive	48
Neuropilin 1	positive	49
Perforin	positive	50
TGF-β	positive	51

调节性T细胞的富集

利用CD4、CD25和CD127富集Tregs

Tregs含量低，为了下游实验富集往往是必要的。已有几种富集全部Tregs或其亚群的方法。虽然FoxP3是目前公认的Tregs最特异的指标，但因其位于细胞内而限制了它在分离活的Tregs中的应用。其他用于富集的有阴性选择的、阳性选择的或联合使用。一种已报道的阴性选择方法是除去表达CD127和CD49d的细胞。阳性选择是收集表达CD4阳性和CD25强阳性的细胞。联合的方法包括在细胞分选前使用磁珠除去非目的细胞群。一个最好的富集方法是收集CD4 ⁺、CD25 ⁺和CD127 ^-细胞。

利用CD4和CD25富集Tregs

在人类，最初的Tregs亚群的分析表明只有体外高水平表达CD25（约占总CD4 T细胞2-3%）的细胞在体外才有抑制功能，这是相对于把高表达CD25的细胞都当做Tregs的小鼠细胞而言。而且表达低到中等水平CD25的细胞在体外没有抑制活性
另外，CD25表达的高与低水平缺乏统一标准并且用流式细胞仪分选人的活Tregs时有一定局限性。结果，许多研究者仅选择高表达CD25的细胞，明显减少Tregs分选产量。这些结果迫使要想得到高产量的人Tregs必须寻找除了CD4和CD25外其他的表面标记。

用CD127判定和分离人的活Tregs

用CD4、CD25和CD127染色人CD4 T细胞可以富集活的Tregs细胞进行进一步培养或其他的体外实验。用这种方法，通过细胞分选可快速分出活的Tregs细胞。BD Pharmingen的人调节T细胞试剂盒，将三色试剂混在一起，利用CD4⁺CD25^int/highCD127^low圈门简化了富集活Tregs细胞过程。这种方法分选的CD25int/highTregs细胞的回收率增加了2-4倍，而且减少了CD25 ^-/int效应细胞的污染。

用磁珠分选预富集CD4+细胞可以增加人Treg细胞的产量

人Tregs占全部CD4⁺细胞的小部分。一种增加Tregs产量的方法是用BD IMagTM磁珠技术预富集CD4+细胞和采用CD127分选细胞结合起来。
BD IMag人CD4 T淋巴细胞富集试剂盒（Cat. No. 557939 ）方便预富集CD4⁺T细胞。可达90%以上的纯度。分离PBMC时残留的红细胞、血小板和CD4T细胞以外的白细胞通过磁场时从样本中清除而形成富集的CD4群体。富集细胞染色如左图所示。
细胞用抗人CD4 PerCP（Cat. No. 345770 ）、CD25FITC（Cat. No. 555431）和CD127PE（Cat. No. 557938)染色。用BD FACSAriaTM细胞分选仪分选富集细胞。详细的方案和圈门方法可查询 bdbiosciences.com/treg.

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