兔视网膜母细胞瘤抑制蛋白(PRB) ELISA 试剂盒  96T/48T

产品规格：96T/48T

实验方法：夹心法

检测范围：78-5000pg/mL

检测限：34.2pg/mL

·

· 离开了细胞培养皿，还能愉快做实验吗

· 培育皿一般用玻璃或塑料制成，是培育微生物或细胞培育的常用试验耗材，一般玻璃的能够用于植物资料、微生物培育和动物细胞的贴壁培育也可能用到。塑料的可能是聚乙烯资料的，合适试验室接种、划线、分离细菌的操作，能够用于植物资料的培育。培育皿易碎，在清洗和运用时要当心轻拿轻放，运用完后要及时清洗洁净，存放在安全、固定的方位。

培育皿的清洁：

1、浸泡：新的或用过的玻璃器皿要先用清水浸泡，软化和溶解附着物。新玻璃器皿运用前得先用自来水简略冲刷，然后用5%盐酸浸泡过夜；用过的玻璃器皿往往附有许多蛋白质和油脂，干枯后不易冲刷掉，故用后应立即浸入清水中备冲刷。

2、冲刷：将浸泡后的玻璃器皿放到洗刷剂水中，用软毛刷重复冲刷。不要留死角，并避免损坏器皿外表的光洁度。将冲刷洁净的玻璃器皿洗净、晾干，备浸酸。

3、.浸酸：浸酸是将上述器皿浸泡到清洁液中，又称酸液，通过酸液的强氧化作用铲除器皿外表的可能残留物质。浸酸不该少于六小时，一般过夜或更长。放取器皿要当心。

4、冲刷：冲刷和浸酸后的器皿都必须用水充沛冲刷，浸酸后器皿是否冲刷的洁净，直接影响到细胞培育的胜败。手艺洗刷浸酸后的器皿，每件器皿至少要重复“－倒空”15次以上，后用重蒸水浸洗2－3次，晾干或烘干后包装备用。

· 培育皿运用留意事宜：

1、运用前通过清洁消毒，培育皿清洁与否对作业影响较大，可影响培育基的酸碱度，若有某些化学药品的存在，会按捺细菌成长。

2、新购的培育皿应先用热水冲刷，再置于分数为1%或2%的盐酸溶液中浸泡数小时，使游离碱性物质除掉，再用蒸馏水冲刷2次。

3、若要培育细菌，再用高压蒸气(一般6.8*10的5次方Pa高压蒸气)，120℃的温度下30min灭菌，置室温中枯燥，或用干热灭菌，就是将培育皿置于烘箱内，温度控制在120℃左右的情况下保持2h，即可杀死细菌的胞牙。

4、通过消毒的培育皿才干接种培育运用。

·

ELISA试剂盒里都包含了哪些？

一、浓缩

由于净化进程中引入的溶剂，可能会下降待测组分的浓度或许不适宜直接分析，需求去除悉数有机溶剂。即试剂盒前处理进程中把样本在60℃氮气下吹干，再用复溶液溶解单调残留物。

浓缩办法：氮气吹干除杂、压缩空气吹干除杂。

二、均质

①组织样本：肉、肝食品类切细，用绞肉机反复绞碎，混合均匀。

②水产样本：去除样品的非食用部分，食用部分切细，用均质器均浆；材料表面较脏时,需适当用蒸馏水清洗。

③蛋类：鲜蛋去壳，蛋黄和蛋白充分混匀。

④生果、蔬菜类：先用水洗去泥沙，ELISA试剂盒然后除去表面的水分，取食用部分。

· 三、振荡提取

· 将提取溶剂参与到装有样品的具塞容器中，振荡，使提取溶剂与容器内的样品充分接触以深化到样本组织内部，提取待测组分。

①振荡办法：振荡器上进行上下、往复式振荡、手摇式上下振荡。

②在组织样本中参与有机溶剂之间提取时，应边加边振荡，避免组织凝集成团，不利于提取。

四、请留心：

①在吹干样本之前，用甲醇清洗针头，避免杂质烦扰。

②在吹样本时，针头应在液面上空，避免与样本接触，避免发作交叉污染。

③样本吹干后应当即取下，ELISA试剂盒避免吹的时间过长，影响毕竟检测成果。

④不同的药物，吹干后样本的保质期不同，建议待样本回到室温后当即复溶。

兔视网膜母细胞瘤抑制蛋白(PRB) ELISA 试剂盒  96T/48T|

如何ELISA试剂盒的质量

一、办法学的影响

ELISA测定模式包含以下几种：双抗体夹心法、间接法、双抗原夹心法、IgM抗体捕捉法、竞赛抑制法，其中竞赛抑制法(HBeAb,HBcAb等采用)因受操作时差所引起的平竞赛等要素的影响，成果重复性较差，质量较难控制。

二、试剂要素

不同批次的ELISA试剂在制造进程中很难确保质量一致，即使是经过批批检的项目其检测成果也存在差异，因而必须选择和订货长批号的试剂，并确保保存条件。严厉执行这一规范可以防止因试剂批号改动而从头树立质控系统及从头评估试剂的杂乱进程，并且可以确保成果的稳定性；对于效期短、使用率低的试剂，应当小量分装，每次使用则取分装部分即可，防止重复冻融造成试剂的失效。

·

· 三、样本要素

· 标本搅扰要素包含内源性搅扰要素和外源性搅扰要素，ELISA试剂盒前者包含类风湿因子、补体、异嗜性抗体、自身抗体等，后者包含标本溶血、标本被细菌污染、标本储存时间过长、标本凝结不全、冷冻标本的重复冻融等。

·

· 四、操作要素

· ELISA操作步骤杂乱，操作不当将引起较大的误差。加样、温育、洗涤、显色、比色。

·

· 五、灰区的设置

· 通常情况下，ELISA定性实验以“阳性”和“阴性”来陈述成果，两者间有一条分界线被称为

· “阳性判断值”(cut-off value，CO值)，这是定性免疫测定成果陈述的依据。

·

· 六、标本复查

· ELISA手工检测进程杂乱，影响要素较多，即使室内质控在控，也可能因孔间差异而造成成果的差异，因而加大复查力度是确保成果准确性的牢靠办法，比如对HBsAg、HBeAg、HCV-Ab、HIV-Ab、TP-Ab等项目的可疑、弱阳性标本及罕见模式的检测成果进行复查。

·

· 七、常表明成果的常用办法

· 1.定性测定

· 2.半定量测定 成果一般以滴度表明。

· 3.定量测定 即用已知量的规范品作一系列稀释后进行ELISA测定，制作规范曲线，成果以jue对量或单位表明。在ELISA试剂盒定量检测中每一块反应板都必须制作相应的规范曲线。

·

· 不按说明书操作会造成的后果

· 每一个试剂盒里都会有对应的说明书，注意事项里大多都会提到“实验严格按照说明书的操作进行”。为什么要严格按照说明书操作？为了更完整的回答这个问题，需要先回顾一下ELISA各种方法的原理。

· 根据试剂的来源和标本的性状及检测的具体条件，可设计出不同类型的检测方法。大致分为以下几类：

· 1.双抗体夹心法测抗原

· 2.双抗原夹心法测抗体

· 3.竞争法测抗原

· 4.间接法测抗体

·

稳定性
经测定，试剂盒在有期内按推荐温度保存，其活性降低率小于5%。为减小外部因素对试剂盒破坏前后检测值的影响，实验室的环境条件需尽量保持一致，尤其是实验室内温度、湿度及温育条件。其次由同一实验员来进行操作可减少人为误差。

注意：
试剂盒内酶标条可拆卸，按实验需求可分多次使用；使用后的剩余试剂盒建议在实验后 1个月内使用完毕。产品过期时间以盒子上的标签为准，保质期内所有组分都确保是稳定的。

兔视网膜母细胞瘤抑制蛋白(PRB) ELISA 试剂盒  96T/48T

一个包装的本试剂盒，包括标准品检测，可以进行96次检测。
保存条件：
除标准品外，4℃保存6个月内。标准品4℃保存，1-2周内，-20℃保存6个月内。

注意事项：
   由于标准品一般是冻干粉，在制备后需要严格校准，所以标准品的瓶数及每瓶标准品所需加入的稀释液体积请以实际收到的试剂盒及标准品标签上的标注为准。
   洗涤液(20X)在低温下可能有结晶，如果发现有结晶，请室温水浴加热使结晶溶解后再配制工作液。
     为标准品的精确性，标准品配制使用后，如果有剩余请勿再次使用。
   TMB对人体有刺激性，操作时请小心，并注意适当防护以避免直接接触人体或吸入体内。
   加样时，请注意每个样品或标准品必须更换枪头，一方面避免交叉污染，另一方面也避免吸取体积的误差。
   不宜混用不同批号的试剂盒组份，每批次试剂盒均经过测试。
   充分混匀对反应结果的性很重要，在加液后请轻轻晃动整个96孔板，以混匀。
   本试剂盒很多操作在室温进行，要求严格控制室温在25-28℃。温度低于25℃会导致终检测到的吸光度显著下降。
   洗涤过程非常重要，洗涤不充分会使精确度下降并导致结果误差较大。
   检测标准品和样品时建议设置重复孔，以确保检测结果的可信度。
   加样过程中须避免气泡的产生。

本产品限于专业人员的科学研究用，不得用于临床诊断或治疗，不得用于食品或药品，不得存放于普通住宅内。

为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。

使用说明：
1. 样品准备
a. 样品的准备请按下列流程进行操作：
(a) 细胞上清样品离心取上清即可(如100-500g，5分钟)。
(b) 对于血清样品，将全血在室温放置30分钟至2小时，不要剧烈摇晃以免溶血，待全血自然凝固并析出血清后，4℃约1000-2000g离心10分钟，取黄色上清即得血清，注意不要吸取白色或淡黄色沉淀。制备好的血清需置于冰上待用。
(c) 对于血浆样品，采集的全血使用肝素或者EDTA进行抗凝处理，混匀后置冰上，4℃约1000-2000g离心10分钟，取黄色或淡黄色上清即得血浆，注意不要吸取白色沉淀。制备好的血浆需置于冰上待用。
(d) 若待测样品不能及时检测，样品制备后请分装，冻存于-20℃或-80℃，并注意避免反复冻融。
b. 血清样品不应添加任何防腐剂或抗凝剂。
c. 样品应清澈透明，检测前样品中如有悬浮物应通过离心去除。
d. 请勿使用溶血、高血脂或污染的样品检测，否则结果将不准确。
注：血清或血浆样品可能需要用样品分析缓冲液适当稀释后再检测。

2. 检测前准备工作
a. 试剂盒从冰箱中取出后应置室温(25-28℃)平衡20分钟；每次检测后剩余试剂请及时置于4℃保存。

b. 配制适当量的洗涤液：将洗涤液(20X)用双蒸水或去离子水稀释至1X，例如10ml洗涤液(20X)加190ml水混匀后即为1X的洗涤液。
c. 按标准品标签上标注的体积加入标准品稀释液至1瓶标准品中，室温孵育15分钟(为确保标准曲线的准确性，切勿缩短孵育时间)。随后轻轻混匀并用移液枪吹打几次使标准品溶解，使标准品终浓度达到4000pg/ml。

通常每个浓度的标准品需要检测2个孔，每个孔的标准品用量为100μl，共需200μl，同时稀释时还需要使用250μl，因此如果1瓶标准品配制后的体积不足0.45ml，请使用更多瓶数的标准品，并在合并混匀后使用。

d. 取5个洁净的1.5毫升离心管，每管预先加入250μl的标准品稀释液，并参考图2进行标准品的倍比稀释，得到4000、2000、1000、500、250、125pg/ml共六个标准品浓度，将稀释好的标准品依次加入预包被板孔中，标准品稀释液直接加入作为0pg/ml浓度，共七个标准品浓度。

ELISA实验因灵敏度高，特异性强在生物科研上得到了认可，但对初学者而言，如不注意实验操作过程中的各个环节，可能会对实验结果产生比较大的影响，比如实验出现白板，显色弱灵敏度低，花板无梯度背景高等现象。下面对以上实验现象进行一一解析。

1.白板现象
在完成所有实验步骤进行底物TMB溶液显色后，酶标板中所有孔的颜色均为无色，即无信号呈现。
出现该现象的可能原因：
a.试剂已过保质期，不同批次稀释液交叉使用。
b.错加漏加检测A，检测B或者底物溶液TMB。
c.洗板或者加样过程中，酶标记物被污染失活，稀释液中含有酶抑制剂如叠氮呐等。
d.配置稀释液的蒸馏水可能被污染。
e.洗涤液是浓缩型的，没有按比例进行稀释。
f.酶标记物的活性和效价比较低。

g.溶液的PH值不正确，一般稀释液的PH值应保持在7.2-7.4。
2.显色弱灵敏度低
在完成所有实验步骤进行底物TMB溶液显色后，酶标板中孔的显色比较浅，即只有微弱的信号呈现。
出现该现象的可能原因：
a.产品过保存期，试剂没有按规定进行适当的保存。
b.试剂，标准品或者样品在使用前没有平衡到室温。
c.少加了试剂的量或者加入试剂的稀释比例不当。
d.洗板或者加样过程中，酶标物受污染失活。
e.孵育时间和孵育温度未达到实验要求。
f.洗涤液稀释倍数不符合要求，洗板次数过多，洗板冲击力过大，洗板浸泡时间过长。
g.底物溶液TMB显色时间太短。

3.花板无梯度背景高
在完成所有实验步骤进行底物TMB溶液显色后，酶标板中的孔有颜色但没有梯度，背景也可能较高.

出现该现象的可能原因：
a.底物溶液TMB未置于阴凉避光处保存，实验前溶液已经变蓝。
b.孵育温度过高或者孵育时间过长，发生了较强的非特异性吸附。
c.没有按说明书要求洗板，特别是洗板时洗涤液的量少加了。
d.加样时没有换枪头造成交叉污染。
e.花板现象：低浓度或者低活性的包被抗体或者检测抗体，封闭不足导致的本底不稳定，洗板不充分，包被板子的问题。

总结如果不按说明书操作可能会出现的不满意结果。

A. 先说严重的操作错误，看错或压根不看试剂盒配套说明书，不按操作步骤加样。比如把竞争法的试剂盒当作双抗体夹心法来做，导致的结果就是整板显示很强的蓝色，无任何梯度。

B. 混用别的试剂盒里的试剂。不同厂家或者相同厂家的不同试剂盒，所含的试剂成分很可能是不一样的，混用导致的结果是，浪费珍贵的样本，样品的回收率达不到预期值，如果混用不同试剂盒的酶复合物，会导致显色过弱或过强，因为每种试剂盒所用酶复合物效价可能不一样。

C. 不看文献或者不做预实验。比如某个试剂盒按照其灵敏度范围和文献报道推算样本应该1:10稀释，结果稀释成1:1000，导致的结果是显色过弱，结果不可用。

D. 不校准移液器及培养箱的温度湿度。导致工作试剂浓度不准确，孵育温度不合适，实验带来误差。

E. 洗涤不充分，每孔洗液加样过少，或者残留。导致的结果是显色过快，同时背景较高。

F. 手洗板时所用枪头没有悬空加入洗液，导致洗液污染，整个实验失败。

G. 剩余酶标板条未及时放入干燥袋，导致酶标板受潮，下一次再做时，显色过弱或污染，CV值过高。

综上所述：在ELISA实验中应注意以下问题：
1.在实验前应该按相关要求将实验试剂平衡至室温。
2.包被抗体和检测抗体应该是有高活性的且都针对同一抗原。
3.试剂保存：蛋白抗体类试剂保存于-20摄氏度，显色液洗涤液保存于2-8摄氏度。
4.各试剂在使用前应充分混匀，以试剂的均一性和准确性。
5.严格控制反应温度和反应试剂。
6.洗板次数，洗板液的量，洗板液浸泡时间的长短，洗板的力度都是应该注意的问题。
7.相关浓缩液应按要求稀释到相应比例方可使用，PH值要保持在7.2-7.4之间。
8.在终止反应时尽量避免微孔中存有气泡。
9.终止反应完成后应该在2min内完成酶标仪读数。
特别提示：本公司的所有产品用于科研实验，严禁用于临床医疗及其他非科研用途！