产品信息

产品描述

Hieff NGS^? G-Type In-Situ DNA Binding Profiling Library Prep Kit for Illumina^?是针对Illumina^?高通量测序平台专门研发的用于原位靶蛋白DNA结合图谱测序文库转座酶法构建试剂盒，适用于100-1,000,000个细胞起始量的样本建库，也提供了应用于单细胞的可能性。相较于传统的ChIP-seq、CUT&RUN和CUT&Tag，本试剂盒优化了反应和建库流程，具有文库构建时间更短（仅需7小时）、操作更简单、对起始样本要求更低、抗体投入量更少、文库产量更高等优点。经过细胞捕获、一抗孵育、二抗孵育、转座酶孵育、转座酶激活、掺入DNA标准品、细胞裂解、磁珠回收gDNA、文库扩增和磁珠分选，靶蛋白结合的DNA片段最终转化为适用于Illumina^?平台测序的文库。

试剂盒包含两个独立模块，BOX-I的核心为结合细胞的ConA磁珠和回收DNA的磁珠。BOX-II包含细胞透化剂，蛋白酶抑制剂，抗体结合buffer，转座酶结合buffer，蛋白酶K以及后续文库扩增所需的所有试剂。此外，本试剂盒已在不同种类细胞的验证（如293、K562、CHO、ESC细胞等），均具有良好的建库效率和建库产量。提供的所有试剂都经过严格的质量控制和功能验证，程度上保证了文库构建的稳定性和重复性。

产品组分

【注】：*测序时 Index 序列 N501-TAGATCGC，N701-TAAGGCGA。

运输与保存方法

冰袋运输。效期一年。存储温度如下，切不可搞错！

Box I：2-8℃保存；Box II：-20℃保存。

注意事项

一、 关于操作

1. 为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。

2. 请于使用前将试剂盒各组分置于室温解冻。解冻后上下颠倒数次充分混匀，短暂离心后置于冰上待用。

3. 推荐在带热盖的PCR仪中进行各步骤反应，使用前应预热PCR仪至反应温度附近。

4. PCR产物因操作不当极容易产生气溶胶污染，进而影响实验结果准确性。推荐将PCR反应配制区和PCR产物纯化检测区进行强制性的物理隔离；配备文库构建专用移液器等设备；定时对各实验区域进行清洁（推荐使用ThermoFisher公司的DNAZap^TM核酸去除喷雾），以保证实验环境的洁净度。

5. 操作细胞应尽量轻柔以保持细胞活性。

6. 本产品仅用作科研用途！

二、 应用范围

本试剂盒适用于动物细胞的靶蛋白DNA结合图谱研究，针对的细胞投入量为100-100,000个，动植物组织和真菌等材料经过特殊处理也可以使用本试剂盒进行相关实验，也提供了应用于单细胞的可能性。

三、 ConA beads操作注意事项

1. 使用前将磁珠平衡至室温，请勿将磁珠置于0℃以下存放。

2. ConA beads与细胞结合后，应避免剧烈震荡或用力吹打磁珠-细胞复合物使细胞应力损伤与磁珠分离。

3. 高细胞投入量（超过50万细胞）在长时间孵育过程中出现部分磁珠聚集为正常现象，以轻弹管底或轻轻吹打使磁珠重悬。

4. 在处理磁珠溶液时应尽量避免高转速离心或长时间置于磁力架上，人为造成磁珠凝集。

5. 避免磁珠长时间暴露在空气中使得磁珠干裂或者磁珠-细胞复合物损伤（不超过3 min）。

6. 本产品仅用作科研用途!

四、关于DNA Selection Beads纯化与分选DNA

1. 建库过程中有多个步骤需要使用DNA纯化磁珠，我们推荐使用Hieff NGS^? DNA Selection Beads (Yeasen Cat#12601)或AMPure^? XP磁珠(Beckman Cat#A63880)进行DNA纯化和分选。

2. 磁珠使用前应先平衡至室温，否则会导致得率下降、分选效果不佳。

3. 请勿将磁珠置于0℃以下存放。

4. 磁珠每次使用前都应充分振荡混匀或使用移液器上下吹打充分混匀。

5. 转移上清时，请勿吸取磁珠，即使微量残留都将影响后续文库质量。

6. 磁珠洗涤使用的80%乙醇应现用现配，否则将影响回收效率。

7. 产物洗脱前应将磁珠置于室温干燥。干燥不充分容易造成无水乙醇残留影响后续反应；过分干燥又会导致磁珠开裂进而降低纯化得率。通常情况下，室温干燥3 min足以让磁珠充分干燥。

8. DNA纯化或长度分选产物如需保存，可使用0.1×TE Buffer洗脱，产物于4°C可保存2天，-20°C可保存1个月。

五、关于试剂

1. 不同的Buffer试剂应注意保存条件，避免失效。

2. Digitonin有细胞毒性，且容易降解。在溶液配制过程中请做好个人防护。加入Digitonin的溶液应现配现用，在4度放置不超过2天。

六、文库结构

七、关于二抗的选择

Hieff NGS^? A-Type In-Situ DNA Binding Profiling Library Prep Kit for Illumina^?( Yeasen Cat#12597)试剂盒提供的是Protein A与转座酶融合的转座子复合物， Hieff NGS^? G-Type In-Situ DNA Binding Profiling Library Prep Kit for Illumina^?(Yeasen Cat#12598)提供的是Protein A/G与转座酶融合的转座子复合物。这两个试剂盒可以直接用于CUT&Tag实验；实验中使用二抗，请根据二抗种属来源与Protein A或者Protein A/G的亲和能力进行选择，可以参照以下表格：

【注】：+++++代表亲和能力非常强，+++代表亲和能力中等，+代表亲合能力很弱，-代表没有亲合能力。

八、关于文库扩增

1. 本试剂盒中的文库扩增组分由本公司高保真DNA聚合酶所组成，大大增强了扩增的均一性，即使是低拷贝的基因，也能进行无偏好性地扩增。

2. 推荐使用本公司的Hieff NGS? Tagment Index Kit for Illumina? (96 Index) (Yeasen Cat#12610)模块进行文库扩增，该模块提供了96种不同组合的双端index文库制备引物，程度上保证了文库构建的稳定性和重复性。

3. 文库扩增步骤需要严格控制扩增循环数。循环数不足，将导致文库产量低；循环数过多，又将导致文库偏好性增加、重复度增加、嵌合产物增加、扩增突变积累等多种不良后果。表2和表3列举了在293细胞中，使用Tri-Methyl-Histone H3 (Lys27) (C36B11) Rabbit mAb一抗（Cell Signaling Technology Cat#9733）或Histone H3K4me3 antibody (pAb)一抗（Active Motif Cat# B_2615077）和Guinea Pig anti-Rabbit IgG (Heavy & Light Chain) antibody二抗（antibodies-online Cat#ABIN101961）和本试剂盒进行文库扩增，细胞投入量与相应扩增循环数的推荐。

表2.细胞投入量与扩增循环数推荐表（H3K27me3）*

表3. 细胞投入量与扩增循环数推荐表（H3K4me3）*

【注】：*由于不同靶蛋白的表达量、DNA结合能力差异较大。实验中需根据建库起始细胞量、蛋白类型、细胞类型和样本处理情况适当调整扩增循环数。推荐在PCR之前使用qPCR的方法对转座酶插入的片段进行初步定量判断再决定循环数。

九、关于DNA标准品

 DNA spike-in mix（5 pg/uL）是来源于大肠杆菌 Lambda DNA的三段序列，长度分别为230bp、250bp和300bp，摩尔浓度比约为1：3：10(见图1)。标准品主要用于在不同处理条件下或者不同细胞状态下对测序数据进行标准化，有利于对测序数据进行定量分析，每10万投入量细胞加入1uL即可，也可根据靶蛋白的结合DNA能力和丰度自行调整。标准品序列：

十、关于文库质检

1. 通常情况下，构建好的文库可通过长度分布检测和浓度检测来进行质量评价。

2. 文库浓度检测可使用：基于双链DNA荧光染料的方法，如Qubit^?、PicoGreen^?等；基于qPCR定量的方法。

3. 推荐使用qPCR方法进行文库浓度检测：Qubit^?等基于双链DNA荧光染料的浓度测定方法时，无法有效区分单端连接Adapter的产物、两端均未连接Adapter的产物及其他不完整双链结构产物；qPCR定量基于PCR扩增原理，仅定量样品中两端Adapter完整的文库（即可测序的文库），可排除单端或双端都不连接Adapter的不可测序文库的干扰。

4. 文库长度分布检测，可通过Qsep、Agilent Bioanalyzer 2100等基于毛细管电泳或微控流原理的设备进行检测。

十一、自备材料

1. 抗体：靶蛋白的一抗和相对应的二抗。

2. 文库质检：Agilent 2100 Bioanalyzer DNA 1000 Chip/ High Sensitivity Chip或其他等效产品；文库定量试剂。

3. 其他材料：无水乙醇、无菌超纯水、低吸附枪头、PCR管、磁力架、PCR仪等。

4.  Hieff NGS^? Tagment Index Kit for Illumina^? (96 Index)（Cat#12610）或其他替代引物。

使用方法

一、细胞准备

1. 在室温条件下收集细胞并计数，死亡的细胞染色质松散，暴露出大量的裸DNA，转座酶复合物随机切割会造成比较强的噪音信号，建议样本细胞活性不低于80% (细胞活性可以用台盼蓝染色来鉴定)。

2. 贴壁较紧的细胞如Hela细胞等可用Accutase或者Trypsin部分消化获得。

3. 植物或真菌细胞可通过特殊处理获得原生质体或细胞核进行实验，方法可参考附录四。

4. 新鲜或者冻存的动物组织可通过特殊处理获得细胞悬液进行实验，方法可参考附录四附录五。

二、操作流程

图2. 原位DNA结合图谱测序建库试剂盒原理示意图和操作流程

三、操作步骤

3.1 溶液配制（0.5 h）

1. 提前10 min取出ConA bind buffer 、Cell wash buffer 、Protease Inhibitor Cocktail (EDTA-free) 和5% Digitonin，待恢复到室温后，颠倒10次混匀后瞬离。

2. BF1：取900 μL Cell wash buffer中加入9 μL Protease Inhibitor Cocktail ( EDTA-free) 。标为Cell wash buffer(-)，混匀后瞬离。

3. BF2：取250 μL BF1-Cell wash buffer(-)，加入2.5 μL 5% Digitonin。标记为Cell wash buffer(+)，混匀后瞬离。储存在室温，若过夜则储存在4℃，使用前提前10 min取出恢复至室温。

4. BF3：取400 μL BF1-Cell wash buffer(-)，加入0.8 μL 5% Digitonin和20 μL 3M NaCl。标记为Tag buffer(+)，混匀后瞬离。储存在室温，若过夜则储存在4℃，使用前提前10 min取出恢复至室温。

5. BF4：提前配制含一抗的 Wash buffer(+)：取48.5 μL BF2-Cell wash buffer (+)，加入1 μL 50×x Protein blocker，和0.5 μL 一抗(按说明书推荐免疫荧光IF抗体使用浓度，对照抗体用IgG)，混匀后瞬离，储存在室温。（对照组可以用加IgG或不加一抗的BF4）

3.2 细胞捕获（0.5 h）

1. 细胞准备：在室温下收获细胞并计数，取100-1,000,000个细胞，室温，600×x g离心3 min，吸除上清。加入140 μL BF1-Cell wash buffer(-)，轻轻吹打重悬；室温，600×x g离心3 min，吸除上清；加入90 μL BF1-Cell wash buffer(-)，轻轻吹打重悬，转移至PCR管中。（【注】：对于大小不同的细胞，请根据实际情况调整离心力）

2. 磁珠活化：颠倒或轻轻旋涡振荡混匀Con A珠浆（4T小包装磁珠体积较小，可以瞬离后用移液枪吹吸10次混匀），对于每个约100-1,000,000个细胞的样品，取10 μL Con A磁珠于已预加40 μL ConA bind buffer的PCR管中吹吸混合，静置于磁力架至磁珠贴壁，吸除管内全部溶液；取下EP管，加入50 μL ConA bind buffer，吹吸混合，静置于磁力架至磁珠贴壁；吸除管内全部溶液，取下EP管，加入10 μL ConA bind buffer，吹吸混合。

3. 活化后的磁珠与细胞结合：将重悬在ConA bind buffer中的珠浆轻轻滴加在细胞悬液中，颠倒5次混匀后，将PCR管置于旋转仪上混匀5-10 min。

3.3 结合一抗，二抗和转座酶（2.5 h）

【注】：结合细胞后的磁珠需要轻柔操作，避免剧烈涡旋或用尖口移液枪头反复吹吸导致细胞损伤，建议颠倒、轻轻涡旋、轻弹底部或者用平口枪头轻轻吹吸等方式混匀，避免产生大量气泡，避免磁珠在磁力架上放置过长时间和直接暴露在空气中时间过长（不超过3 min）造成磁珠结块及细胞破裂）。

1. 将与细胞结合好的磁珠取下，瞬离(< 100x ×g)，静置于磁力架至磁珠贴壁（不超过2 min）；吸去PCR管中全部液体；加入50 μL BF4-含一抗的 Wash buffer(+)，轻轻涡旋或轻弹底部混匀（对照组可以用加IgG或不加一抗的BF4）。

2. 室温下旋转孵育2 h或者4 °C旋转孵育过夜。水平旋转，保证液体在管底。每隔30 min可轻弹底部混匀，避免磁珠聚集干结。

3. 将与一抗结合好的磁珠取下，瞬离(< 100×gxg)，静置于磁力架至磁珠贴壁（不超过2 min）。吸去PCR管中全部液体。

4. 加入49.5 μL BF2-Cell wash buffer (+)后，再加入0.5 μL二抗(1:100稀释)， 轻轻涡旋或轻弹底部混匀。（若样品较多，二抗结合液可一起提前配制）

5. 室温下旋转孵育0.5 h-1 h。水平旋转，保证液体在管底。每隔30 min轻弹底部或者轻轻涡旋混匀，避免磁珠聚集干结。

6. a. 将与二抗结合好的磁珠取下，瞬离(< 100×gxg)，静置于磁力架至磁珠贴壁（不超过2 min）。吸去PCR管中全部液体。加入65 μL BF2-Cell wash buffer (+)，轻轻颠倒或涡旋离心管10次，充分分离磁珠及细胞。

b. 瞬离(< 100×g)x g)，静置于磁力架至磁珠贴壁（不超过2 min），吸去PCR管中全部液体。再加入65 μL BF2-Cell wash buffer (+)，轻轻颠倒或涡旋离心管10次，充分分离磁珠及细胞。

一共清洗磁珠两次

7. 将磁珠瞬离（<100×gx g），静置于磁力架至磁珠贴壁（不超过2 min），吸去PCR管中全部液体。

8. 加入49 μL BF3-Tag buffer(+)后，再加入1 μL pA/G-Transposome Mix。轻轻涡旋或轻弹底部混匀。（若样品较多，Transposome结合液可一起提前配制）

（【注】：不同的实验环境，转座酶的切割活性可能不同，请根据实际情况，在此基础上调整转座酶的使用浓度。本试剂盒中转座酶复合物的浓度为2.5 μM）。

9. 室温下旋转孵育1 h。水平旋转，保证液体在管底。每隔30 min轻弹底部混匀或者轻轻涡旋，避免磁珠聚集干结。

（【注】：转座酶孵育可能会导致轻微的磁珠板结。孵育太久（超过3 h）会造成转座酶非特异性结合到DNA上，增强了背景噪音）。

10. a. 瞬离（<100×x g），静置于磁力架至磁珠贴壁（不超过2 min），吸去PCR管中全部液体。加入100 μL BF3-Tag buffer(+)，轻轻颠倒或涡旋离心管10次，充分分离磁珠及细胞。

b. 瞬离（<100×xg g），静置于磁力架至磁珠贴壁（不超过2 min），吸去PCR管中全部液体。加入100 μL BF3-Tag buffer(+)，轻轻颠倒或涡旋离心管10次，充分分离磁珠及细胞。

c. 瞬离（<100×x g），静置于磁力架至磁珠贴壁（不超过2 min），吸去PCR管中全部液体。加入100 μL BF3-Tag buffer(+)，轻轻颠倒或涡旋离心管10次，充分分离磁珠及细胞。

一共清洗磁珠3次。

3.4 转座酶激活（1 h）

1. 将磁珠瞬离（<100×x g），静置于磁力架至磁珠贴壁（不超过2 min）。吸去PCR管中全部液体。加入 30 μL BF3-Tag buffer(+)后，再加入1 μL 30×x Activating buffer。轻轻涡旋或轻弹底部混匀。（若样品较多，激活缓冲液可一起提前配制）

2. 37 °C旋转孵育1 h。水平旋转，保证液体在管底。每隔30 min轻弹底部混匀，避免磁珠聚集干结。

3.5 蛋白酶K消化和基因组DNA回收（1 h）

1. 向每个样品中加入2 μL 15×x Terminate Solution、1 μL DNA Spike-in mix和1 μL 30×x Proteinase K（此时磁珠会板结）（若样品较多，可一起提前配制）。全速转速涡旋样品约10 sec，混匀后瞬离，将样品置于PCR仪，在55 oC消化30 min (热盖不低于70 oC)或者37 oC过夜。

2. 短暂离心（<100×x g），将离心管置于磁力架上静置3 min，取30 μL上清。

（【注】：DNA Spike-in mix主要用于不同处理条件或者细胞状态下的测序数据标准化和定量分析，为非必需加入的组分。客户可根据实验需要判断是否加入DNA Spike-in mix。每10万投入量细胞加入1 uL即可，也可根据靶蛋白的结合DNA能力和丰度自行调整。具体请参见注意事项。）

3. 加入40 μL室温下平衡的DNA Selection Beads，涡旋混匀或移液器吹打10次混匀，室温静置孵育5 min。

4. 短暂离心（<100×x g），将离心管置于磁力架上静置3 min，待磁珠完全贴壁后吸除PCR管中溶液。保持PCR管始终处于磁力架中，从另一侧加入200 μL 80％乙醇，避免直接冲刷磁珠，静置30-60 s。吸除液体，保持PCR管始终处于磁力架中，再次加入200 μL 80％乙醇，静置30-60 s。吸除干净液体，保持PCR管始终处于磁力架中，开盖空气干燥磁珠至刚刚出现龟裂（不超过3 min）。从磁力架上取下PCR管，加入21 μL ddH2O，并充分涡旋。室温静置5 min。

5. 将PCR管短暂离心并置于磁力架中分离磁珠和液体。待溶液澄清后（约5 min），小心转移20 μL上清至干净的管中，于-20℃保存。

3.6 文库扩增

1. 将表4中试剂解冻后颠倒混匀，置于冰上备用。

2. 于无菌PCR管中配制表4所示反应。

表4. PCR扩增反应

【注】：*Hieff NGS^? Tagment Index Kit for Illumina^? (96 Index)（Cat#12610ES96）中提供8种N5XX和12种N7XX，可根据样品数量和Index选择策略自行选择。

3. 使用移液器轻轻吹打或振荡混匀，并短暂离心将反应液收集至管底。

4. 将PCR管置于PCR仪中，设置表5所示反应程序，进行PCR扩增。

表5. PCR扩增反应程序

【注】：*此步不可省略。转座反应产物并非完整的双链DNA，72℃孵育3 min用于生成成熟的PCR模板。

**由于不同靶蛋白的表达量、DNA结合能力差异较大。实验中需根据建库起始细胞量、蛋白类型、细胞类型和样本处理情况适当调整扩增循

环数。推荐在PCR之前使用qPCR的方法对转座酶插入的片段进行初步定量判断再决定循环数。组蛋白修饰作为靶蛋白所使用的PCR循环数

可参考表2和表3。

3.7 文库纯化

1. 将平衡至室温的DNA Selection Beads磁珠，振荡或上下颠倒混匀。加入60 μL（1.2×x）室温下平衡的DNA Selection Beads，涡旋混匀或移液器吹打10次混匀，室温静置孵育5 min。

2. 短暂离心（<100×x g），将离心管置于磁力架上静置3 min，待磁珠完全贴壁后吸除PCR管中溶液。保持PCR管始终处于磁力架中，从另一侧加入200 μL 80％乙醇，避免直接冲刷磁珠，静置30-60 s。吸除液体，保持PCR管始终处于磁力架中，再次加入200 μL 80％乙醇，静置30-60 s。吸除干净液体，保持PCR管始终处于磁力架中，开盖空气干燥磁珠至刚刚出现龟裂（不超过3 min）。从磁力架上取下PCR管，加入21 μL ddH2O，并充分涡旋。室温静置5 min。

3. 将PCR管短暂离心并置于磁力架中分离磁珠和液体。待溶液澄清后（约5 min），小心转移20 μL上清至干净的管中，于-20℃保存。此外，如需获得长度分布更集中的文库扩增产物，可使用胶回收方式进行长度分选和纯化；如对文库长度分布范围等无特殊要求，扩增产物也可不进行长度分选，直接使用磁珠或柱纯化试剂盒进行纯化。文库大小可使用Agilent 2100 Bioanalyzer、Qsep或者凝胶电泳进行检测。

3.8 文库分选（根据靶蛋白抗体选择）

1. 由于抗体的结合效率、不同靶蛋白在染色质上结合区域的差异以及不同种类细胞的染色质状态差异，文库大小可能存在不同模式的分布。我们推荐一种磁珠分选的方法，可以有效去掉文库中的，使得文库大小主峰约520bp左右，即两个核小体保护DNA长度的插入片段。客户可根据建好的文库大小自行决定是否需要进行磁珠分选。

2. 进行双轮分选时，需将初始DNA样本用灭菌蒸馏水补齐至100 μL，加入60 μL (0.6×x)室温下平衡的DNA Selection Beads，涡旋混匀或移液器吹打10次混匀，室温静置孵育5 min。

3. 短暂离心（<100×x g），将PCR管置于磁力架上静置5 min，待溶液澄清后，小心转移上清到干净的离心管中（残留3-5 μL，避免吸到磁珠）。加入50 μL (0.5×x)室温下平衡的DNA Selection Beads，涡旋混匀或移液器吹打10次混匀，室温静置孵育5 min。

4. 短暂离心（<100×x g），将离心管置于磁力架上静置3 min，待磁珠完全贴壁后吸除PCR管中溶液。保持PCR管始终处于磁力架中，从另一侧加入200 μL 80％乙醇，避免直接冲刷磁珠，静置30-60 s。吸除液体，保持PCR管始终处于磁力架中，再次加入200 μL 80％乙醇，静置30-60 s。吸除干净液体，保持PCR管始终处于磁力架中，开盖空气干燥磁珠至刚刚出现龟裂（不超过3 min）。从磁力架上取下PCR管，加入21 μL ddH2O，并充分涡旋。室温静置5 min。

5. 将PCR管短暂离心并置于磁力架中分离磁珠和液体。待溶液澄清后（约5 min），小心转移20 μL上清至干净的管中，于-20℃保存。此外，如需获得长度分布更集中的文库扩增产物，可使用胶回收方式进行长度分选和纯化；如对文库长度分布范围等无特殊要求，扩增产物也可不进行长度分选，直接使用磁珠或柱纯化试剂盒进行纯化。

3.9 文库质量控制

通常情况下，构建好的文库可通过浓度检测和长度分布检测来进行质量评价，具体请参见注意事项。

附录

一、组蛋白修饰H3K27me3和H3K4me3 DNA结合图谱建库

分布使用Tri-Methyl-Histone H3 (Lys27) (C36B11) Rabbit mAb（Cell Signaling Technology Cat#9733）、Histone H3K4me3 antibody (pAb)（Active Motif Cat# B_2615077）和Normal Rabbit IgG（Cell Signaling Technology Cat#2729）作为一抗、Guinea Pig anti-Rabbit IgG (Heavy & Light Chain) antibody作为二抗（antibodies-online Cat#ABIN101961）。使用Hieff NGS^? G-Type In-Situ DNA Binding Profiling Library Prep Kit for Illumina^?对100-1,000,000个293细胞投入量样本建库，并分别使用1.2×磁珠进行纯化，再使用0.6×x, 0.4×x磁珠分选，文库大小结果使用Qsep和2%琼脂糖凝胶电泳进行检测。

图3. Qsep和琼脂糖凝胶电泳进行文库质量分析

二、不同细胞投入量的H3K27me3 DNA结合图谱建库测序

使用Tri-Methyl-Histone H3 (Lys27) (C36B11) Rabbit mAb作为一抗（Cell Signaling Technology Cat#9733）、Guinea Pig anti-Rabbit IgG (Heavy & Light Chain) antibody作为二抗（antibodies-online Cat#ABIN101961）。使用Hieff NGS^? G-Type In-Situ DNA Binding Profiling Library Prep Kit for Illumina^?对100-1,000,000个293细胞投入量样本建库，并分别使用1.2×磁珠进行纯化，结果使用Qsep进行检测。文库测序后与ENCODE中的H3K27me3 ChIP-seq数据进行比较。

图4. Qsep对不同细胞投入量文库质量分析

图5.利用本试剂盒鉴定不同细胞投入量条件下H3K27me3在染色质上的信号分布和相关性

三、不同细胞投入量的H3K4me3 DNA结合图谱建库测序

使用Histone H3K4me3 antibody (pAb)作为一抗（Active Motif Cat# B_2615077）、Guinea Pig anti-Rabbit IgG (Heavy & Light Chain) antibody作为二抗（antibodies-online Cat#ABIN101961）。使用Hieff NGS^? G-Type In-Situ DNA Binding Profiling Library Prep Kit for Illumina^?对100-1,000,000个293细胞投入量样本建库，并分别使用1.2×磁珠进行纯化，结果使用Qsep进行检测。文库测序后与ENCODE中的H3K4me3 ChIP-seq数据进行比较。

图6.  Qsep对不同细胞投入量文库质量分析

图7. 利用本试剂盒鉴定不同细胞投入量条件下H3K4me3在染色质上的信号分布和相关性

四、 植物组织细胞核的分离。

3.1 溶液配制（0.5 h）

1. 提前10 min取出ConA bind buffer 、Cell wash buffer 、Protease Inhibitor Cocktail (EDTA-free) 和5% Digitonin，待恢复到室温后，颠倒10次混匀后瞬离。

2. BF1：取900 μL Cell wash buffer中加入9 μL Protease Inhibitor Cocktail ( EDTA-free) 。标为Cell wash buffer(-)，混匀后瞬离。

3. BF2：取250 μL BF1-Cell wash buffer(-)，加入2.5 μL 5% Digitonin。标记为Cell wash buffer(+)，混匀后瞬离。储存在室温，若过夜则储存在4℃，使用前提前10 min取出恢复至室温。

4. BF3：取400 μL BF1-Cell wash buffer(-)，加入0.8 μL 5% Digitonin和20 μL 3M NaCl。标记为Tag buffer(+)，混匀后瞬离。储存在室温，若过夜则储存在4℃，使用前提前10 min取出恢复至室温。

5. BF4：提前配制含一抗的 Wash buffer(+)：取48.5 μL BF2-Cell wash buffer (+)，加入1 μL 50×x Protein blocker，和0.5 μL 一抗(按说明书推荐免疫荧光IF抗体使用浓度，对照抗体用IgG)，混匀后瞬离，储存在室温。

6. 核提取液缓冲液A：10 mM Tris pH 8.0, 10 mM KCl, 0.5 mM spermidine。

7. 核提取液缓冲液B：10 mM Tris pH 8.0, 10 mM KCl, 0.5 mM spermidine, 0.5% Triton X-100, 0.1% Protease Inhibitor Cocktail。

8. 核提取液缓冲液C：10 mM Tris pH 8.0, 150 mM NaCl, 0.5 mM spermidine, 0.1% Protease Inhibitor Cocktail。

3.2 植物细胞核分离和捕获（1 h）

1. 为避免叶绿体或线粒体等细胞器DNA产生的数据背景，我们建议对植物组织进行细胞核提取处理。称取0.2 g新鲜植物组织（如叶片等），加入液氮充分碾磨成冻干粉末。将碾磨好的粉末使用6 mL预冷的核提取液缓冲液A悬浮并转移至15 ml离心管中，颠倒震荡混匀。

2. 使用100-200目筛网对细胞核悬液进行过滤处理（若起始材料较少，可以不经过此操作步骤）。

3. 使用平口或者剪刀剪平的移液枪头将细胞核悬液分装至1.5 mL离心管中，每管1 mL。600×xg g，4℃离心5 min，去掉上清。

4. 加入1 mL预冷的核提取液缓冲液B重悬沉淀后，600×g，4℃离心5 min，去掉上清。

5. 加入1 mL核提取液缓冲液C轻轻震荡重悬沉淀后，600×g，4℃离心5 min，去掉上清。重复三次后。将细胞核重悬于90 ul核提取液缓冲液C中。

6. 磁珠活化步骤：取10 μL Con A磁珠于已预加40 μL ConA bind buffer的PCR管中吹吸混合，静置于磁力架至磁珠贴壁，吸除管内全部溶液；取下EP管，加入50 μL ConA bind buffer，吹吸混合，静置于磁力架至磁珠贴壁；吸除管内全部溶液，取下EP管，加入10 μL ConA bind buffer，吹吸混合。

7. 磁珠与细胞核结合：将重悬在ConA bind buffer中的珠浆轻轻滴加在细胞核悬液中，颠倒5次混匀后，将PCR管置于旋转仪上混匀5-10 min。

按照3.3开始进行实验（不需要进行3.2步骤）。

五、 动物组织细胞的分离。

3.1 溶液配制（0.5 h）

1. 提前10 min取出ConA bind buffer 、Cell wash buffer 、Protease Inhibitor Cocktail (EDTA-free) 和5% Digitonin，待恢复到室温后，颠倒10次混匀后瞬离。

2. BF1：取900 μL Cell wash buffer中加入9 μL Protease Inhibitor Cocktail ( EDTA-free) 。标为Cell wash buffer(-)，混匀后瞬离。

3. BF2：取250 μL BF1-Cell wash buffer(-)，加入2.5 μL 5% Digitonin。标记为Cell wash buffer(+)，混匀后瞬离。储存在室温，若过夜则储存在4℃，使用前提前10 min取出恢复至室温。

4. BF3：取400 μL BF1-Cell wash buffer(-)，加入0.8 μL 5% Digitonin和20 μL 3M NaCl。标记为Tag buffer(+)，混匀后瞬离。储存在室温，若过夜则储存在4℃，使用前提前10 min取出恢复至室温。

5. BF4：提前配制含一抗的 Wash buffer(+)：取48.5 μL BF2-Cell wash buffer (+)，加入1 μL 50×x Protein blocker，和0.5 μL 一抗(按说明书推荐免疫荧光IF抗体使用浓度，对照抗体用IgG)，混匀后瞬离，储存在室温。

6. 细胞缓冲液A：20 mM HEPES-KOH pH 7.5, 150 mM NaCl, 0.5 mM spermidine。

3.2 动物细胞分离和捕获（1 h）

1. 称取0.2 g新鲜动物组织（黄豆粒大小），加入液氮充分碾磨成冻干粉末。将碾磨好的粉末使用6 mL细胞缓冲液A悬浮并转移至15 mL离心管中，颠倒震荡混匀。

2. 使用100-200目筛网对细胞悬液进行过滤处理（若起始材料较少，可以不经过此操作步骤）。

3. 使用平口或者剪刀剪平的移液枪头将细胞核悬液分装至1.5 ml离心管中，每管1 mL。600×x g，4℃离心5 min，去掉上清。

4. 加入140 μL BF1-Cell wash buffer(-)，轻轻吹打重悬；室温，600×x g离心3 min，吸除上清；加入90 μL BF1-Cell wash buffer(-)，轻轻吹打重悬，转移至PCR管中。（【注】：对于大小不同的细胞，请根据实际情况调整离心力）

5. 磁珠活化步骤：取10 μL Con A磁珠于已预加40 μL ConA bind buffer的PCR管中吹吸混合，静置于磁力架至磁珠贴壁，吸除管内全部溶液；取下EP管，加入50 μL ConA bind buffer，吹吸混合，静置于磁力架至磁珠贴壁；吸除管内全部溶液，取下EP管，加入10 μL ConA bind buffer，吹吸混合。

6. 磁珠与细胞结合：将重悬在ConA bind buffer中的珠浆轻轻滴加在细胞悬液中，颠倒5次混匀后，将PCR管置于旋转仪上混匀5-10 min。

按照3.3开始进行实验（不需要进行3.2步骤）。

HB210906