Hieff NGS? MaxUp II Dual-mode mRNA Library Prep Kit for Illumina?

MaxUp II 双模式mRNA 建库试剂盒

产品信息

Hieff NGS^? MaxUp^TM II Dual-model mRNA Library Prep Kit for Illumina^?是针对Illumina^?高通量测序平台专门研发的用于mRNA转录组文库构建试剂盒，本试剂盒将cDNA二链合成与Endprep、dA-tailing进行合并，极大地缩减建库时间。二链合成模块配有两种buffer，客户可根据需要进行常规建库或链特异性建库。本产品适用于起始模板为0.1-4 μg不同来源真核生物总RNA样本。经过mRNA分离、片段化、双链cDNA合成、末端修复、加A尾、接头连接和文库扩增，总RNA样品最终转化为适用于Illumina^?平台测序的文库。产品描述

试剂盒包含两个独立模块，BOX-I的核心为纯化mRNA所需的oligo(dT)磁珠。BOX-II包含mRNA片段化试剂，反转录试剂，常规和链特异性dscDNA合成，以及后续建库所需的所有试剂。其中链特异性二链合成buffer中将dTTP替换为dUTP，使cDNA第二链中掺入dUTP，而本试剂盒使用的高保真DNA聚合酶无法扩增含尿嘧啶的DNA模板，实现链特异性。提供的所有试剂都经过严格的质量控制和功能验证，最大程度上保证了文库构建的稳定性和重复性。

产品组分

运输与保存方法

冰袋运输。效期一年。存储温度如下，切不可搞错！

Box I：2-8℃保存；Box II：-20℃保存。

注意事项

一、 关于操作

1.为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。

2.请于使用前将试剂盒各组分置于室温解冻。解冻后上下颠倒数次充分混匀，短暂离心后置于冰上待用。

3.推荐在带热盖的PCR仪中进行各步骤反应，使用前应预热PCR仪至反应温度附近。

4.请使用无RNase污染的耗材，并对实验区域定期进行清理，推荐使用ThermoFisher公司的RNAZap^TM高效核酸去除喷雾去除RNA酶污染。

5.PCR产物因操作不当极容易产生气溶胶污染，进而影响实验结果准确性。推荐将PCR反应体系配制区和PCR产物纯化检测区进行强制性的物理隔离；配备文库构建专用移液器等设备；定时对各实验区域进行清洁（推荐使用ThermoFisher公司的DNAZap^TM高效核酸去除喷雾），以保证实验环境的洁净度。

二、应用范围

本试剂盒适用于起始模板量为0.1-4 μg（体积≤50 μL）的高质量动物、植物和真菌等真核生物的总RNA。如初始RNA浓度偏低，体积超过50 μL，可使用Hieff NGS^? RNA Cleaner磁珠进行浓缩。RNA需通过Agilent 2100 Bioanalyzer RNA 6000 Nano/Pico芯片检测，RIN值要求＞7，以保证mRNA有完整的poly(A)尾结构。

本试剂盒的mRNA分离模块使用的是oligo (dT)磁珠，只有带poly(A)尾的mRNA才能被提取；其他不具poly(A)尾的RNA，如非编码RNA、无poly(A)尾的mRNA等不能适用本试剂盒。此外，FFPE样本中的mRNA降解严重，通常无完整的poly(A)尾结构，故亦无法使用本试剂盒进行建库。

本试剂盒所制备文库可进行多种RNA-Seq应用，包括：

基因表达（gene expression）

单核苷酸变异检测（single nucleotide variation discovery）

基因融合鉴定（gene fusion identification）

剪切变异体分析（splice variant analysis）

三、关于接头连接（Adapter Ligation）

1.本公司可提供长接头（barcoded Adapter）试剂盒和短接头（也称为小Y接头、不完整接头）试剂盒，客户可根据实验需求进行选择。

目前有48种Indexed Adapters: Hieff NGS^? Complete Adapter Kit for Illumina^?, Set 1~Set 4（Cat#12615~Cat#12618）；单端 96种 Index Primers: Hieff NGS^? 96 Single Index Primers Kit for Illumina^? , Set 1~Set 2 （Cat#12611~Cat#12612）；双端 384 种 Index Primers: Hieff NGS^? 384 Dual Index Primers Kit for Illumina^? , Set 1~Set 2 （Cat#12613~Cat#12614）。

2.我们建议选用高质量的商业化接头，如客户使用自制接头，请委托具有NGS引物合成经验的公司，并备注需进行严格的防污染控制。此外，进行接头退火操作时，请在超净台完成。每次只操作一种接头，防止交叉污染。

3.使用接头时，请提前将接头取出放在4°C或冰盒上解冻；在室温操作时，实验室温度最好不要超过25°C，防止接头解链。

4.建库过程中，接头浓度过高或过低都会导致建库成功率变低。本试剂盒操作方案中，所加入的接头体积固定为5 μL，请根据初始的RNA投入量，参考表1对接头进行稀释。接头稀释液请选择0.1×TE buffer，稀释过的接头可在4°C保存48小时。

表1 Input Total RNA量与接头浓度推荐表

四、关于磁珠纯化与分选（Bead-based Clean Up and Size Selection）

1.建库过程中有多个步骤需要使用DNA纯化磁珠，我们推荐使用Hieff NGS^? DNA Selection Beads (Yeasen Cat#12601)或AMPure^? XP磁珠(Beckman Cat#A63880)进行DNA纯化和分选。

2.磁珠使用前应先平衡至室温，否则会导致得率下降、分选效果不佳。

3.磁珠每次使用前都应充分振荡混匀或使用移液器上下吹打充分混匀。

4.转移上清时，请勿吸取磁珠，即使微量残留都将影响后续文库质量。

5.磁珠洗涤使用的80%乙醇应现用现配，否则将影响回收效率。

6.产物洗脱前应将磁珠置于室温干燥。干燥不充分容易造成无水乙醇残留影响后续反应；过分干燥又会导致磁珠开裂进而降低纯化得率。通常情况下，室温干燥3-5 min足以让磁珠充分干燥。

7.DNA纯化或长度分选产物如需保存，可使用0.1×TE Buffer洗脱，产物于4°C可保存2天，-20°C可保存1个月。

五、关于文库扩增（Library Amplification）

1.本试剂盒中的文库扩增组分由本公司第二代高保真DNA聚合酶所组成，在第一代的基础上，大大增强了扩增的均一性，即使是低拷贝的基因，也能进行无偏好性地扩增。

2.如果您使用Indexed Adapter（也称为长接头、大Y接头），可使用本试剂盒提供的引物Primer mix进行扩增；如果使用的是“短接头”或者叫“小Y接头”，则需要使用index primers进行扩增，加上相应的barcodes。

3.文库扩增步骤需要严格控制扩增循环数。循环数不足，将导致文库产量低；循环数过多，又将导致文库偏好性增加、重复度增加、嵌合产物增加、扩增突变积累等多种不良后果。表2列举了使用本试剂盒进行文库扩增，Input Total RNA量与相应扩增循环数的推荐。

表2 Input Total RNA量与扩增循环数推荐表*

【注】：*由于不同物种和组织所提取的Total RNA中，mRNA的含量差异较大。实验中需根据建库起始量、物种类型及样本处理情况适当调整扩增循环数。

六、关于文库质检（Library Quality Analysis）

1.通常情况下，构建好的文库可通过长度分布检测和浓度检测来进行质量评价。

2.文库浓度检测可使用：基于双链DNA荧光染料的方法，如Qubit^?、PicoGreen^?等；基于qPCR绝对定量的方法。

3.推荐使用qPCR方法进行文库浓度检测：Qubit^?等基于双链DNA荧光染料的浓度测定方法时，无法有效区分单端连接Adapter的产物、两端均未连接Adapter的产物及其他不完整双链结构产物；qPCR绝对定量基于PCR扩增原理，仅定量样品中两端Adapter完整的文库（即可测序的文库），可排除单端或双端都不连接Adapter的不可测序文库的干扰。

4.文库浓度检测不可使用：基于光谱检测的方法，如NanoDrop^?等。

5.文库长度分布检测，可通过Agilent Bioanalyzer 2100等基于毛细管电泳或微控流原理的设备进行检测。

使用方法

一、自备材料

1.纯化磁珠：Hieff NGS^? DNA Selection Beads（Cat#12601）或AMPure XP Beads（Cat#A63880）或其他等效产品。

2.RNA质控：Agilent 2100 Bioanalyzer RNA 6000 Nano/Pico Chip或其他等效产品。

3.Adapters：barcoded adapter（长接头）或者无barcode的短接头试剂盒。

4.文库质检：Agilent 2100 Bioanalyzer DNA 1000 Chip/ High Sensitivity Chip或其他等效产品；文库定量试剂。

5.其他材料：无水乙醇、无菌超纯水、低吸附枪头、PCR管、磁力架、PCR仪等。

二、操作流程

图1 mRNA建库试剂盒操作流程

三、操作步骤

3.1 mRNA纯化和片段化（mRNA Purification and Fragmentation）

1.将mRNA Capture Beads从2-8℃取出，静置使其温度平衡至室温，约30 min。

2.准备一个Nuclease free离心管，取0.1-4 μg总RNA，用Nuclease free水将体积补至50 μL，冰上放置备用。

3.颠倒或旋涡振荡混匀磁珠，吸取50 μL磁珠悬液加入至50 μL总RNA样品中，用移液器吹打6次，使其充分混匀。

4.将磁珠与RNA的混合物置于PCR仪中，65℃，5 min；4℃，hold，使得RNA变性。

5.室温孵育5 min，使mRNA与磁珠完全结合。

6.将样品置于磁力架中，室温静置5 min，使mRNA与总RNA分离，小心移除上清。

7.将样品从磁力架上取出，用200 μL Beads Wash Buffer重悬磁珠，移液器反复吹打6次以彻底混匀。将样品置于磁力架中，室温静置5 min，小心移除上清。

8.重复步骤7，共洗涤两次。

9.将样品从磁力架上取出，加入50 μL Tris Buffer重悬磁珠，用移液器反复吹打6次以彻底混匀。

10.将样品置于PCR仪中，80℃，2 min；25℃，hold，将mRNA洗脱下来。

11.将样品从PCR仪中取出，加入50 μL Beads Binding Buffer，用移液器反复吹打6次以彻底混匀。

12.室温放置5 min，使mRNA结合到磁珠上。

13.将样品置于磁力架中，室温静置5 min，小心移除上清。

14.将样品从磁力架上取出，用200 μL Beads Wash Buffer重悬磁珠，移液器反复吹打6次以彻底混匀，将样品重新放回

至磁力架中，室温静置5 min，吸掉全部上清。

【注】：最后需要用10 μL移液器吸干净残留液体。

15.将样品从磁力架上取出，用18.5 μL Frag/Prime buffer重悬磁珠，用移液器吹打6次以彻底混匀；将样品置于PCR仪中（预设为94℃或85℃），可参考表3选择片段化程序，但不同物种片段化的效果有差异，客户可先根据自己的情况，做个片段化时间的梯度，比如94℃，5 min或85℃，6 min。使用Agilent 2100分析双链cDNA纯化产物大小。

表3 mRNA片段化程序选择

16. 片段化程序结束后，为防止poly(A)尾RNA与磁珠结合，请立即将样品置于磁力架中，待溶液澄清后，转移17 μL上清至一个新的nuclease free离心管中，立刻进入第一链合成反应。

3.2 第一链cDNA的合成：

1. 将第一链合成试剂从-20°C取出，颠倒混匀后瞬离。按表4所示，配制第一链cDNA合成的反应液。

表4 第一链cDNA合成反应体系

2. 使用移液器轻轻吹打混匀，瞬离将反应液离心至管底。

3. 将上述PCR管置于PCR仪中，按照表5所示设置反应程序，进行第一链cDNA的合成。反应结束后立即进行第二链cDNA的合成。

表5 第一链cDNA合成反应程序

3.3第二链cDNA的合成/末端修复/加A：

1. 将第二链合成试剂从-20 °C取出，解冻后颠倒混匀；按照表6所示，配制第二链cDNA合成/末端修复/加A反应液。

表6 第二链cDNA合成反应体系

【注】：*如构建普通mRNA文库，请使用含dNTP的buffer；如构建链特异性mRNA文库，请使用含dUTP的buffer。

2. 使用移液器轻轻吹打混匀，瞬离将反应液离心至管底。

3. 将上述PCR管置于PCR仪中，按照表7所示设置反应程序，进行第二链cDNA的合成。

表7 第二链cDNA合成反应程序

3.4 接头连接（Adapter Ligation）

该步骤可在末端修复和dA尾添加的产物末端，连接特定的Illumina^?接头。

1. 参考注意事项三中的表1，根据Input RNA量，稀释Adapter至合适浓度。

2. 将表8中各试剂解冻后颠倒混匀，置于冰上备用。

3. 于3.3步骤结束后的PCR管中继续配制表8所示反应体系。

表8 Adapter Ligation体系

【注】：*Ligation Enhancer使用前请上下颠倒、振荡，充分混匀并瞬时离心后使用。

**本公司接头原始浓度为15 μM, 请根据注意事项三表1的提示，用0.1×TE buffer对接头进行稀释，使接头添加体积固定为5 μL。

4. 使用移液器轻轻吹打混匀，并短暂离心将反应液收集至管底。

5. 将PCR管置于PCR仪中，设置表9所示反应程序，进行接头连接反应：

表9 Adapter Ligation反应程序

【注】：当Input DNA量较低时，可尝试将连接时间延长一倍，这将提高连接效率。

3.5 连接产物纯化和片段大小分选（Post Ligation Clean Up and Size Selection）

目前有两个方案应用于该步骤，当插入片段＜200 bp时，使用方案A；当插入片段≥200 bp时，使用方案B。

方案A：适用于插入片段150-200 bp的文库（如mRNA打断方案为94°C，6 min）

1. 准备工作：将Hieff NGS^? DNA Selection Beads磁珠由冰箱中取出，室温平衡至少30 min。配制80%乙醇。

2. 涡旋振荡或充分颠倒磁珠以保证充分混匀。

3. 吸取60 μL Hieff NGS^? DNA Selection Beads（0.6×，Beads:DNA=0.6:1）至Adapter Ligation产物中，涡旋或吹打混匀，室温孵育5 min。

4. 将PCR管短暂离心并置于磁力架中分离磁珠和液体，待溶液澄清后（约5 min），小心移除上清。

5. 保持PCR管始终置于磁力架中，加入200 μL新鲜配制的80%乙醇漂洗磁珠，室温孵育30 sec后，小心移除上清。

6. 重复步骤5，总计漂洗两次。

7. 保持PCR管始终置于磁力架中，开盖空气干燥磁珠至刚刚出现龟裂（不超过5 min）。

8. 将PCR管从磁力架中取出，加入21 μL ddH₂O，涡旋振荡或使用移液器轻轻吹打至充分混匀，室温静置5 min。将PCR管短暂离心并置于磁力架中静置，待溶液澄清后（约5 min），小心移取20 μL上清至新PCR管中，进行PCR扩增。

方案B：适用于插入片段大于200 bp的文库（如mRNA打断方案为94°C，5 min或85℃，8 min）

方案B-1：接头连接产物的纯化

1. 准备工作：将Hieff NGS^? DNA Selection Beads磁珠由冰箱中取出，室温平衡至少30 min。配制80%乙醇。

2. 涡旋振荡或充分颠倒磁珠以保证充分混匀。

3. 吸取60 μL Hieff NGS^? DNA Selection Beads（0.6×，Beads:DNA=0.6:1）至Adapter Ligation产物中，涡旋或吹打混匀，室温孵育5 min。

4. 将PCR管短暂离心并置于磁力架中分离磁珠和液体，待溶液澄清后（约5 min），小心移除上清。

5. 保持PCR管始终置于磁力架中，加入200 μL新鲜配制的80%乙醇漂洗磁珠，室温孵育30 sec后，小心移除上清。

6. 重复步骤5，总计漂洗两次。

7. 保持PCR管始终置于磁力架中，开盖空气干燥磁珠至刚刚出现龟裂（不超过5 min）。

8. 将PCR管从磁力架中取出，加入102 μL ddH₂O，涡旋振荡或使用移液器轻轻吹打至充分混匀，室温静置5 min。将PCR管短暂离心并置于磁力架中静置，待溶液澄清后（约5 min），小心移取100 μL上清至新PCR管中，准备进行双轮分选。

【注】：Ligation Enhancer中含有的高浓度PEG会对磁珠双轮分选产生影响，所以必须经过一轮纯化后再进行双轮分选。

方案B-2：双轮分选

1. 请涡旋振荡或充分颠倒磁珠以保证混匀。

2. 根据DNA片段长度要求，参考表10，在上述100 μL DNA中加入第一轮分选磁珠，涡旋或移液器吹打10次混匀。

表10文库分选推荐磁珠比例

【注】：此表推荐的双轮分选比例适用于AMPure^? XP磁珠和Hieff NGS^? DNA Selection Beads；表中“×”表示样品DNA体积。如所需文库插入片段主峰为300 bp时，若在短接头连接之后分选，样品DNA体积为100 μL，则第一轮分选磁珠使用体积为0.65×100 μL=65 μL，第二轮分选磁珠使用体积为0.15×100 μL=15 μL；若在长接头连接之后分选，样品DNA体积为100 μL，则第一轮分选磁珠使用体积为0.62×100 μL=62 μL，第二轮分选磁珠使用体积为0.15×100 μL=15 μL。

3. 室温孵育5 min。

4. 将PCR管短暂离心并置于磁力架中，待溶液澄清后（约5 min），小心转移上清到干净的离心管中，残留1-2 μL溶液于管底。

5. 参考表10向上清中加入第二轮分选磁珠。

6. 涡旋混匀或移液器吹打10次混匀，室温静置5 min。

7. 将PCR管短暂离心并置于磁力架中，待溶液澄清后（约5 min），小心移除上清。

8. 保持PCR管始终处于磁力架中，加入200 μL新鲜配制的80%乙醇漂洗磁珠，室温孵育30 sec，小心移除上清。

9. 重复步骤8。

10. 保持PCR管始终处于磁力架中，开盖干燥磁珠至刚刚出现龟裂（约5 min）。

11. 将PCR管从磁力架中取出，加入21 μL ddH₂O，涡旋振荡或使用移液器轻轻吹打充分混匀，室温静置5 min。

12. 将PCR管短暂离心并置于磁力架中分离磁珠和液体。待溶液澄清后（约5 min），小心转移20 μL上清至干净管中。

3.6文库扩增（Library Amplification）

该步骤将对纯化或长度分选后的接头连接产物进行PCR扩增富集。

1. 将表11中的试剂解冻后颠倒混匀，置于冰上备用。

2. 于无菌PCR管中配制表11所示反应体系。

表11-A  短接头连接产物PCR反应体系                                  表11-B  长接头连接产物PCR反应体系

【注】：*如果使用的是无barcode的接头，俗称短接头（小Y接头），请使用短接头试剂中配备的index primer进行扩增（Cat#12611，Hieff NGS^? 96 Single Index Primers Kit for Illumina^?, Set 1; Cat#12612, Hieff NGS^? 96 Single Index Primers Kit for Illumina^?, Set 2。Cat#12613, Hieff NGS^? 384 Dual Index Primers Kit for Illumina^? , Set 1; Cat#12614，Hieff NGS^? 384 Dual Index Primers Kit for Illumina^? , Set 2。）

**如果您使用的是barcoded adapter，俗称长接头（大Y接头），即adapter上带有barcode的完整接头，可用试剂盒中的Primer Mix进行扩增；

3. 使用移液器轻轻吹打或振荡混匀，并短暂离心将反应液收集至管底。

4. 将PCR管置于PCR仪中，设置表12示反应程序，进行PCR扩增。

表12  PCR扩增反应程序

3.7 扩增产物磁珠纯化或分选（Post Amplification Clean Up/Size Selection）

同3.5步骤中纯化操作步骤。使用Hieff NGS^? DNA Selection Beads（0.9×，Beads:DNA=0.9:1）纯化文库扩增产物。

3.8 文库质量控制

通常情况下，构建好的文库可通过浓度检测和长度分布检测来进行质量评价，具体请参见注意事项六。

附录一：mRNA片段化

图2. mRNA不同打断时间对应的双链cDNA片段范围。取1 μg Universal Human Reference RNA，经mRNA提取试剂盒提取后，分别以94°C，6 min、85℃，8 min和85℃，5 min处理。打断后mRNA进行双连cDNA的合成，经过1.8×磁珠回收后，通过Agilent 2100 Bioanalyzer进行检测。

【注】：本结果使用的RNA是Agilent公司的Universal Human Reference RNA，若使用其他来源的RNA，最好优化打断时间。

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