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Hieff NGSTM MaxUp Dual-mode mRNA Library Prep Kit for Illumina® mRNA建库试剂盒
Hieff NGSTM MaxUp Dual-mode mRNA Library Prep Kit for Illumina® mRNA建库试剂盒
  • Hieff NGSTM MaxUp Dual-mode mRNA Library Prep Kit for Illumina® mRNA建库试剂盒

Hieff NGSTM MaxUp Dual-mode mRNA Library Prep Kit for Illumina® mRNA建库试剂盒

产品报价:2826元

更新时间:2024/3/11 13:18:23

地:上海

牌:翌圣生物

号:12301ES08

厂商性质: 生产型,贸易型,服务型,

公司名称: 翌圣生物科技(上海)股份有限公司

产品关键词: 反转录试剂   mRNA建库试剂盒   Illumina  

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翌圣生物科技(上海)股份有限公司 : (13916792673) (400-6111-883)

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HB181026

Hieff NGSTM MaxUp Dual-mode mRNA Library Prep Kit for Illumina?

mRNA建库试剂盒

产品信息

产品名称

产品编号

规格

储存

价格(元)

Hieff NGSTM MaxUp Dual-mode mRNA Library Prep Kit for   Illumina?

12301ES08

8 T

详见保存方法

2826.00

12301ES24

24 T

详见保存方法

9756.00

12301ES96

96 T

详见保存方法

32856.00

产品描述

Hieff NGSTM MaxUp Dual-mode mRNA Library Prep Kit for Illumina?是针对Illumina?高通量测序平台专门研发的用于mRNA转录组文库构建试剂盒,本试剂盒cDNA二链合成模块配有两种buffer,客户可根据需要进行常规建库或链特异性建库。本产品适用于起始模板为10 ng-1μg不同来源真核生物总RNA样本。经过mRNA分离、片段化、链双链cDNA合成、末端修复、加A尾、接头连接和文库扩增,总RNA样品最终转化为适用于Illumina?平台测序的文库。

试剂盒包含三个独立模块,BOX-I的核心为纯化mRNA所需的polyA)磁珠。BOX-II包含mRNA片段化试剂,反转录试剂,常规和链特异性dscDNA合成所需的所有试剂。其中链特异性二链合成buffer中将dTTP替换为dUTP,使cDNA第二链中掺入dUTP,而本试剂盒使用的高保真DNA聚合酶无法扩增含尿嘧啶的DNA模板,实现链特异性。BOX-III实际上是一个高效的微量DNA文库构建试剂盒,来自我公司的Hieff NGSTM MaxUp II DNA Library Prep Kit for Illumina?。提供的所有试剂都经过严格的质量控制和功能验证,最大程度上保证了文库构建的稳定性和重复性。

产品组分

组分编号和名称

12301ES08

12301ES24

12301ES96

BOX-I

12603-A


mRNA Capture Beads

0.4 mL

1.2 mL

4.8 mL

12603-B


Bead Binding Buffer

0.4 mL

1.2 mL

4.8 mL

12603-C


Beads Wash Buffer

5 mL

15 mL

60 mL

12603-D


Tris Buffer

0.4 mL

1.2 mL

4.8 mL

BOX-II

12250-A


Frag/Prime Buffer

150 μL

450 μL

900 μL×2

12250-B


1st Strand Synthesis Enzyme Mix

16 μL

48 μL

192 μL

12250-C


Strand Specificity Reagent

50 μL

150 μL

580 μL

12250-D


2nd Strand Synthesis Buffer (with dNTP)

162 μL

485 μL

965 μL×2

12250-E


2nd Strand Synthesis Buffer (with dUTP)

162 μL

485 μL

965 μL×2

12250-F


2nd Strand Synthesis Enzyme Mix

41 μL

121 μL

482 μL

BOX-III

12200-A


Endprep Buffer

48 μL

144 μL

576 μL

12200-B


Endprep Enzyme

32 μL

96 μL

384 μL

12200-C


Ligation Enhancer

240 μL

720 μL

4×720 μL

12200-D


Quick T4 DNA Ligase

40 μL

120 μL

480 μL

12200-E

 

2× Super CanaceTM II   High-Fidelity Mix

200 μL

600 μL

4×600 μL

12200-F


Primer Mix

40 μL

120 μL

480 μL

 

运输与保存方法

冰袋运输。效期一年。存储温度如下,切不可搞错!

Box I2-8℃保存;Box II-20℃保存;Box III-20℃保存。

注意事项

一、 关于操作

1.为了您的安全和健康,请穿实验服并戴一次性手套操作。

2.请于使用前将试剂盒各组分置于室温解冻。解冻后上下颠倒数次充分混匀,短暂离心后置于冰上待用。

3.推荐在带热盖的PCR仪中进行各步骤反应,使用前应预热PCR仪至反应温度附近。

4.请使用无RNase污染的耗材,并对实验区域定期进行清理,推荐使用ThermoFisher公司的RNAZapTM高效核酸去除喷雾去除RNA酶污染。

5.PCR产物因操作不当极容易产生气溶胶污染,进而影响实验结果准确性。推荐将PCR反应体系配制区和PCR产物纯化检测区进行强制性的物理隔离;配备文库构建专用移液器等设备;定时对各实验区域进行清洁(推荐使用ThermoFisher公司的DNAZapTM高效核酸去除喷雾),以保证实验环境的洁净度。

二、应用范围

本试剂盒适用于起始模板量为10-1000 ng(体积≤50 μL)的高质量动物、植物和真菌等真核生物的总RNA。如初始RNA浓度偏低,体积超过50 μL,可使用Hieff NGSTM RNA Cleaner磁珠进行浓缩。RNA需通过Agilent 2100 Boanalyzer RNA 6000 Nano/Pico芯片检测,RIN值要求>7,以保证mRNA有完整的poly(A)尾结构。

本试剂盒的mRNA分离模块使用的是oligo d(T)磁珠,只有带poly(A)尾的mRNA才能被提取;其他不具poly(A)尾的mRNA,如非编码RNA、无poly(A)尾的mRNA等不能适用本试剂盒。此外,FFPE样本中的mRNA降解严重,通常无完整的poly(A)尾结构,故亦无法使用本试剂盒进行建库。

本试剂盒所制备文库可进行多种RNA-Seq应用,包括:

基因表达(gene expression

单核苷酸变异检测(single nucleotide variation discovery

基因融合鉴定(gene fusion identification

剪切变异体分析(splice variant analysis

三、关于接头连接(Adapter Ligation

1.本试剂盒推荐使用短接头(也称为小Y接头、不完整接头)进行建库,目前我公司可提供单端 96 Index Kit 和双端 384 Index Kit

单端 96 Index KitCat#12611Hieff NGSTM 96 Single Index Primer Kit for Illumina? , Set 148 种); Cat#12612Hieff NGSTM 96 Single Index Primer Kit for Illumina?, Set 248 种)。

双端 384 Index KitCat#12613Hieff NGSTM 384 Dual Index Primer Kit for Illumina? , Set 196 种); Cat#12614Hieff NGSTM 384 Dual Index Primer Kit for Illumina? , Set 296 种)。

2.我们建议选用高质量的商业化接头,如客户使用自制接头,请委托具有NGS引物合成经验的公司,并备注需进行严格的防污染控制。此外,进行接头退火操作时,请在超净台完成。每次只操作一种接头,防止交叉污染。

3.使用接头时,请提前将接头取出放在4°C或冰盒上解冻;在室温操作时,实验室温度最好不要超过25°C,防止接头解链。

4.建库过程中,接头浓度过高或过低都会导致建库成功率变低。本试剂盒操作方案中,所加入的接头体积固定为5 μL,请根据初始的RNA投入量,参考表1对接头进行稀释。接头稀释液请选择0.1×TE buffer,稀释过的接头可在4°C保存48小时。

1 Input Total RNA量与接头浓度推荐表

Input Total RNA

Adapter stock concentration

10–100 ng

0.15 μM

100–499 ng

1.5 μM

500–1000 ng

5 μM

四、关于磁珠纯化与分选(Beads-based Clean Up and Size Selection

1.建库过程中有多个步骤需要使用DNA纯化磁珠,我们推荐使用Hieff NGSTM DNA Selection Beads (Yeasen Cat#12601)AMPure? XP磁珠(Beckman Cat#A63880)进行DNA纯化和分选。

2.磁珠使用前应先平衡至室温,否则会导致得率下降、分选效果不佳。

3.磁珠每次使用前都应充分振荡混匀或使用移液器上下吹打充分混匀。

4.转移上清时,请勿吸取磁珠,即使微量残留都将影响后续文库质量。

5.磁珠洗涤使用的80%乙醇应现用现配,否则将影响回收效率。

6.产物洗脱前应将磁珠置于室温干燥。干燥不充分容易造成无水乙醇残留影响后续反应;过分干燥又会导致磁珠开裂进而降低纯化得率。通常情况下,室温干燥3-5 min足以让磁珠充分干燥。

7.DNA纯化或长度分选产物如需保存,可使用0.1×TE Buffer洗脱,产物于4°C可保存1周,-20°C可保存1个月。

五、关于文库扩增(Library Amplification

1.本试剂盒中的文库扩增组分由本公司第二代高保真DNA聚合酶所组成,在第一代的基础上,大大增强了扩增的均一性,即使是低拷贝的基因,也能进行无偏好性地扩增。

2.如果您使用barcoded adapter(也成为长接头、大Y接头),可使用本试剂盒提供的引物Primer mix进行扩增;如果使用的是短接头或者叫Y接头,则需要使用index primers进行扩增,加上相应的barcodes

3.文库扩增步骤需要严格控制扩增循环数。循环数不足,将导致文库产量低;循环数过多,又将导致文库偏好性增加、重复度增加、嵌合产物增加、扩增突变积累等多种不良后果。表2列举了使用本试剂盒进行文库扩增,Input Total RNA量与相应扩增循环数的推荐。

2 Input Total RNA量与扩增循环数推荐表*

Input Total RNA

Number of cycles

10 ng

15–16

100 ng

12-14

1000 ng

8–10

【注】:*如使用链特异性文库构建方案,产量会相对减少,故选择高的循环数;否则,低循环数已经足够获得测序文库。当使用的总RNA质量较差时,可适当增加1-2循环。

六、关于文库质检(Library Quality Analysis

1.通常情况下,构建好的文库可通过长度分布检测和浓度检测来进行质量评价。

2.文库浓度检测可使用:基于双链DNA荧光染料的方法,如Qubit?PicoGreen?等;基于qPCR绝对定量的方法。

3.推荐使用qPCR方法进行文库浓度检测:Qubit?等基于双链DNA荧光染料的浓度测定方法时,无法有效区分单端连接Adapter的产物、两端均未连接Adapter的产物及其他不完整双链结构产物;qPCR绝对定量基于PCR扩增原理,仅定量样品中两端Adapter完整的文库(即可测序的文库),可排除单端或双端都不连接Adapter的不可测序文库的干扰。

4.文库浓度检测不可使用:基于光谱检测的方法,如NanoDrop?等。

5.文库长度分布检测,可通过Agilent Bioanalyzer 2100等基于毛细管电泳或微控流原理的设备进行检测。

 

使用方法

一、自备材料

1.纯化磁珠:Hieff NGSTM DNA Selection BeadsCat#12601)或AMPure XP BeadsCat#A63880)或其他等效产品。

2.RNA质控:Agilent 2100 Bioanalyzer RNA 6000 Nano/Pico Chip或其他等效产品。

3.Adaptersbarcoded adapter(长接头)或者无barcode的短接头试剂盒。

4.文库质检:Agilent 2100 Bioanalyzer DNA 1000 Chip/ High Sensitivity Chip或其他等效产品;文库定量试剂。

5.其他材料:无水乙醇、无菌超纯水、低吸附枪头、PCR管、磁力架、PCR仪等。

二、操作流程

 

1 mRNA建库试剂盒操作流程

三、操作步骤

3.1 mRNA纯化和片段化mRNA Purification and Fragmentation

1.mRNA Capture Beads2-8℃取出,静置使其温度平衡至室温,约30 min

2.准备一个Nuclease free离心管,将0.01-1 μgRNA溶解至50 μL Nuclease free水中,冰上放置备用。

3.颠倒或旋涡振荡混匀磁珠,吸取50 μL磁珠悬液加入至50 μLRNA样品中,用移液器吹打6次,使其充分混匀。

4.将磁珠与RNA的混合物置于PCR仪中,65℃5 min4℃hold,使得RNA变性。

5.室温孵育5 min,使mRNA与磁珠完全结合。

6.将样品置于磁力架中,室温静置5 min,使mRNA与总RNA分离,小心移除上清。

7.将样品从磁力架上取出,用200 μL Beads Wash Buffer,用移液器反复吹打6次以彻底混匀。将样品置于磁力架中,

室温静置5 min,小心移除上清。

8.重复步骤7,共洗涤两次。

9.将样品从磁力架上取出,加入50 μL Tris Buffer重悬磁珠,用移液器反复吹打6次以彻底混匀。

10.将样品置于PCR仪中,80℃2 min25℃hold,将mRNA洗脱下来。

11.加入50 μL Beads Binding Buffer,用移液器反复吹打6次以彻底混匀。

12.室温放置5 min,使mRNA结合到磁珠上。

13.将样品置于磁力架中,室温静置5 min,小心移除上清。

14.将样品从磁力架上取出,用200 μL Beads Wash Buffer,用移液器反复吹打6次以彻底混匀,将样品重新放回至磁力架中,室温静置5 min,吸掉全部上清。

【注】:最后需要用10 μL移液器吸干净残留液体。

15.将样品从磁力架上取出,用18.5 μL Frag/Prime buffer重悬磁珠,用移液器吹打6次以彻底混匀;将样品置于PCR仪中(预设为94℃),根据插入片段大小的需要,可参考表3选择片段化程序,但不同物种片段化的效果有差异,客户可先根据自己的情况,做个片段化时间的梯度,比如51015 min。等合成双链cDNA后,使用Agilent 2100分析大小。

3 mRNA片段化程序选择

插入片段大小(bp

打断程序

Hold

150-200

94°C10~15 min

4°C

200-300

94°C~10 min

4°C

300~400

94°C~8 min

4°C

400-700

94°C~6 min

4°C

16. 片段化程序结束后,立即将样品置于磁力架中,转移17 μL上清至一个新的nuclease free离心管中,立刻进入第一链合成反应。

3.2 双链cDNA的合成与纯化(cDNA Synthesis and Purification

第一链cDNA的合成:

1. 1st Strand Synthesis Reaction Buffer-20°C取出,解冻后颠倒混匀。按表4所示,配制第一链cDNA合成的反应液

4 第一链cDNA合成反应体系

名称

体积(μL

Fragmented mRNA

17

Strand Specificity Reagent

6

1st Strand Synthesis Enzyme Mix

2

2. 使用移液器轻轻吹打或涡旋震荡混匀,瞬离将反应液离心至管底。

3. 将上述PCR管置于PCR仪中,按照表5所示设置反应程序,进行第一链cDNA的合成。反应结束后立即进行第二链cDNA的合成。

第一链cDNA合成反应程序

温度

时间

热盖 105°C

On

25°C

10 min

42°C

15 min

70°C

15 min

4°C

Hold

第二链cDNA的合成

1. 2nd Strand Synthesis Buffer-20 °C取出,解冻后颠倒混匀;按照表6所示,配制第二链cDNA合成反应液。

第二链cDNA合成反应体系

名称

体积(μL

1st   Strand cDNA

25 μL

2nd Strand Synthesis Buffer (with dNTP or dUTP)*

20 μL

2nd Strand Synthesis Enzyme Mix

5 μL

【注】:*如构建普通mRNA文库,请使用含dNTPbuffer;如构建链特异性mRNA文库,请使用含dUTPbuffer

2. 使用移液器轻轻吹打或涡旋震荡混匀,瞬离将反应液离心至管底。

3. 将上述PCR管置于PCR仪中,按照表7所示设置反应程序,进行第二链cDNA的合成。

第二链cDNA合成反应程序

温度

时间

热盖 105°C

Off

16°C

1 h

4°C

Hold

双链cDNA纯化:

该步骤将对获得的双链cDNA进行纯化。

1. Hieff NGSTM DNA Selection Beads DNA (Cat#12601)提前30 min2-8℃取出,室温静置使其温度平衡至室温。

2. 颠倒或旋涡振荡使Hieff NGSTM DNA Selection Beads充分混匀,吸取90 μL (1.8 ×)磁珠悬液加入到第二链cDNA样品(50 μL)中,涡旋振荡或使用移液器吹打使其充分混匀。

3. 室温孵育5 min

4. 磁力架上静置5 min。待溶液澄清后,保持样品始终处于磁力架中,小心移除上清。

5. 保持样品始终处于磁力架中,加入200 μL新鲜配制的80%乙醇漂洗磁珠(注意不要吹散磁珠),室温孵育30 sec,小心移除上清。

6. 重复上一步,总计漂洗2次。

7. 保持样品始终处于磁力架中,开盖空气干燥磁珠5 min

8. 将样品从磁力架中取出,加入51 μL nuclease free水,涡旋振荡或使用移液器吹打充分混匀,室温静置5 min。瞬离后在磁力架上静置5 min,待溶液澄清后,小心吸取50 μL上清至一个新的nuclease free离心管中。

3.3 末端修复/dA尾添加(End Repair/dA-Tailing

该步骤将片段化的双链cDNA末端补平,并进行5’端磷酸化和3’端加dA尾。

1. 将表8中各试剂解冻后,颠倒混匀,置于冰上备用。

2. 于无菌PCR管中配制表8所示反应体系。

末端修复/dA尾添加反应体系

名称

体积(μL

Fragmented dscDNA

50

Endprep Buffer

6

Endprep Enzyme

4

3. 使用移液器轻轻吹打或振荡混匀,并短暂离心将反应液离心至管底。

4. 将上述PCR管置于PCR仪,设置表9所示反应程序,进行末端修复/dA尾添加反应。

末端修复/dA尾添加反应程序

温度

时间

热盖105°C

On

30°C

20 min

72°C

20 min

4°C

Hold

3.4 接头连接(Adapter Ligation

该步骤可在末端修复和dA尾添加的产物末端,连接特定的Illumina?接头。

1. 参考注意事项三中的表1,根据Input RNA量,稀释Adapter至合适浓度。

2. 将表10中各试剂解冻后颠倒混匀,置于冰上备用。

3. 3.3步骤结束后的PCR管中继续配制表10所示反应体系。

10  Adapter Ligation体系

名称

体积(μL

dA-tailed DNA

60

Ligation Enhancer

30*

Quick T4 DNA Ligase

5

DNA Adapter

5**

【注】:*Ligation Enhancer使用前请上下颠倒、振荡,充分混匀并瞬时离心后使用。

**请根据注意事项三中表1的提示,用0.1×TE buffer对接头进行稀释,接头体积固定为5 μL

4. 使用移液器轻轻吹打或振荡混匀,并短暂离心将反应液收集至管底。

5. PCR管置于PCR仪中,设置表11所示反应程序,进行接头连接反应:

11  Adapter Ligation反应程序

温度

时间

热盖105°C

Off

20°C

15 min

4°C

Hold

【注】:当Input DNA量较低时,可尝试将连接时间延长一倍,这将提高连接效率。

3.5 连接产物纯化和片段大小分选(Post Ligation Clean Up and Size Selection

目前有两个方案应用于该步骤,当插入片段<200 bp时,使用方案A;当插入片段≥200 bp时,使用方案B

方案A:适用于插入片段150-200 bp的文库(mRNA打断方案为94°C15 min

1. 准备工作:将Hieff NGSTM DNA Selection Beads磁珠由冰箱中取出,室温平衡至少30 min。配制80%乙醇。

2. 涡旋振荡或充分颠倒磁珠以保证充分混匀。

3. 吸取80 μL Hieff NGSTM DNA Selection Beads0.8×Beads:DNA=0.8:1)至Adapter Ligation产物中,涡旋或吹打混匀,室温孵育5 min

4. PCR管短暂离心并置于磁力架中分离磁珠和液体,待溶液澄清后(约5 min),小心移除上清。

5. 保持PCR管始终置于磁力架中,加入200 μL新鲜配制的80%乙醇漂洗磁珠,室温孵育30 sec后,小心移除上清。

6. 重复步骤5,总计漂洗两次。

7. 保持PCR管始终置于磁力架中,开盖空气干燥磁珠至刚刚出现龟裂(不超过5 min)。

8. PCR管从磁力架中取出,加入21 μL ddH2O,涡旋振荡或使用移液器轻轻吹打至充分混匀,室温静置5 min。将PCR管短暂离心并置于磁力架中静置,待溶液澄清后(约5 min),小心移取20 μL上清至新PCR管中,进行PCR扩增。

方案B:适用于插入片段大于200 bp的文库(mRNA打断方案为94°C5~10 min

方案B-1:接头连接产物的纯化

1. 准备工作:将Hieff NGSTM DNA Selection Beads磁珠由冰箱中取出,室温平衡至少30 min。配制80%乙醇。

2. 涡旋振荡或充分颠倒磁珠以保证充分混匀。

3. 吸取80 μL Hieff NGSTM DNA Selection Beads0.8×Beads:DNA=0.8:1)至Adapter Ligation产物中,涡旋或吹打混匀,室温孵育5 min

4. PCR管短暂离心并置于磁力架中分离磁珠和液体,待溶液澄清后(约5 min),小心移除上清。

5. 保持PCR管始终置于磁力架中,加入200 μL新鲜配制的80%乙醇漂洗磁珠,室温孵育30 sec后,小心移除上清。

6. 重复步骤5,总计漂洗两次。

7. 保持PCR管始终置于磁力架中,开盖空气干燥磁珠至刚刚出现龟裂(不超过5 min)。

8. PCR管从磁力架中取出,加入102 μL ddH2O,涡旋振荡或使用移液器轻轻吹打至充分混匀,室温静置5 min。将PCR管短暂离心并置于磁力架中静置,待溶液澄清后(约5 min),小心移取100 μL上清至新PCR管中,准备进行双轮分选。

【注】:ligation enhancer中含有的高浓度PEG 6000会对磁珠双轮分选产生影响,所以必须经过一轮纯化后再进行双轮分选。

方案B-2:双轮分选

1. 请涡旋振荡或充分颠倒磁珠以保证混匀。

2. 根据DNA片段长度要求,参考表12,在上述100 μL DNA中加入第一轮分选磁珠,涡旋或移液器吹打10次混匀。

12  磁珠文库分选推荐比例

DNA文库插入片段大小(峰值,bp

~ 200

~ 300

~ 400

~500

94℃打断时间(min

10 ~ 15 min

~ 10 min

~ 8 min

~ 6 min

短接头连接之后分选

第一轮体积比

0.82×

0.72×

0.62×

0.58×

第二轮体积比

0.2×

0.15×

0.15×

0.1×

  长接头连接之后分选或文库扩增之后分选

第一轮体积比

0.78×

0.68×

0.58×

0.55×

第二轮体积比

0.15×

0.15×

0.15×

0.15×

【注】:此处文库大小指的是插入片段+短接头长度(60 bp)或插入片段+完整接头长度(120 bp),此表推荐的双轮分选比例适用于AMPure? XP磁珠和Hieff NGSTM DNA Selection Beads;表中“×”表示样品DNA体积。如短接头文库大小为360 bp,样品DNA体积为100 μL,则第一轮分选磁珠使用体积为0.72×100 μL=72 μL;第二轮分选磁珠使用体积为0.15×100 μL=15 μL

3. 室温孵育5 min

4. PCR管短暂离心并置于磁力架中,待溶液澄清后(约5 min),小心转移上清到干净的离心管中,残留1-2 μL溶液于管底。

5. 参考表12向上清中加入第二轮分选磁珠。

6. 涡旋混匀或移液器吹打10次混匀,室温静置5 min

7. PCR管短暂离心并置于磁力架中,待溶液澄清后(约5 min),小心移除上清。

8. 保持PCR管始终处于磁力架中,加入200 μL新鲜配制的80%乙醇漂洗磁珠,室温孵育30 sec,小心移除上清。

9. 重复步骤8

10. 保持PCR管始终处于磁力架中,开盖干燥磁珠至刚刚出现龟裂(约5 min)。

11. PCR管从磁力架中取出,加入21 μL ddH2O,涡旋振荡或使用移液器轻轻吹打充分混匀,室温静置5 min

12. PCR管短暂离心并置于磁力架中分离磁珠和液体。待溶液澄清后(约5 min),小心转移20 μL上清至干净管中。

3.6文库扩增(Library Amplification

该步骤将对纯化或长度分选后的接头连接产物进行PCR扩增富集。

1. 将表13中的试剂解冻后颠倒混匀,置于冰上备用

2. 于无菌PCR管中配制表13所示反应体系。

 

13-A  短接头连接产物PCR反应体系表                               13-B  长接头连接产物PCR反应体系

组分名称

体积(μL

2×Super CanaceTM   II High-Fidelity Mix

25

Primer   mix**

5

Adapter   Ligated DNA

20

组分名称

体积(μL

2×Super CanaceTM   II High-Fidelity Mix

25

Universal Primer/ i5   Primer*

2.5

Index Primer/ i7 Primer*

2.5

Adapter Ligated DNA

20

 

【注】:*如果使用的是无barcode的接头,俗称短接头(小Y接头),请使用短接头试剂中配备的index primer进行扩增(Cat#12611Hieff NGSTM 96 Single Index Primer Kit for Illumina?, Set 1; Cat#12612, Hieff NGSTM 96 Single Index Primer Kit for Illumina?, Set 2Cat#12613, Hieff NGSTM 384 Dual Index Primer Kit for Illumina? , Set 1; Cat#12614Hieff NGSTM 384 Dual Index Primer Kit for Illumina? , Set 2

**如果您使用的是barcoded adapter,俗称长接头(大Y接头),即adapter上带有barcode,可使用本试剂盒中的Primer mix来进行扩增;

3. 使用移液器轻轻吹打或振荡混匀,并短暂离心将反应液收集至管底。

4. PCR管置于PCR仪中,设置表14示反应程序,进行PCR扩增

14  PCR扩增反应程序

温度

时间

循环数

98°C

1 min

1

98°C

10 sec

参照表2(注意事项五)

60°C

30 sec

72°C

30 sec

72°C

5 min

1

4°C

Hold

-

3.7 扩增产物磁珠纯化或分选(Post Amplification Clean Up/Size Selection

3.5步骤中纯化操作步骤。使用Hieff NGSTM DNA Selection Beads0.9×Beads:DNA=0.9:1)纯化文库扩增产物。

3.8 文库质量控制

通常情况下,构建好的文库可通过浓度检测和长度分布检测来进行质量评价,具体请参见注意事项六。

附录一:mRNA片段化

2. mRNA不同打断时间对应的双链cDNA插入片段长度。取500 ng Universal Human Reference RNA,经过mRNA提取试剂盒提取后,分别以94°C处理51015 min。打断后的mRNA进行双连cDNA的合成,经过1.8×磁珠回收后,所得结果通过Agilent 2100 Bioanalyer进行检测。

【注】:本结果使用的RNAUniversal Human Reference RNA,若使用其他来源的RNA,需要优化打断时间;若构建插入片段>300 bp的文库,打断时间请选择5 min (此结果只展示片段化效果,并不代表产量的高低)

附录二:应用实例

使用本试剂盒对500 ng Universal Human Reference RNA建库,mRNA打断时间为94°C5 min,接头连接后进行双轮分选,产物经扩增、纯化后使用Agilent 2100 Bioanalyer进行检测。

 

3. Universal Human Reference mRNA文库构建结果,从左往右依次使用0.8×/0.10.7×/0.1×0.55×/0.1×双轮分选。

 

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