NovoScript®SYBR Two-Step qRT-PCR SuperMix (E093)

NovoScript? Two-Step qRT-PCR SuperMix两步法RT-qPCR试剂盒基于本公司生产的NovoScript? All- in-one 1st Strand cDNA Synthesis SuperMix （novoprotein货号：E043）和NovoStart? SYBR qPCR SuperMix（novoprotein货号：E090），具有灵敏度高，合成能力强，扩增效率高的优点。
该试剂盒能以动物、植物和微生物的总RNA或mRNA为模板，用NovoScript? All- in-one 1st Strand cDNA Synthesis SuperMix进行反转录，用NovoScript? SYBR qRT-PCR SuperMix进行荧光定量。
本制品配有不同浓度的ROX Reference Dye，用于不同仪器校正孔与孔之间产生的荧光信号误差。

• 第一链cDNA合成

  融化后，将试剂盒中各组分混匀并稍微离心后置于冰上。

• 按顺序加入下面的反应物
  

  模板RNA	总RNA(0.1 ng -5μg)
  	poly(A) mRNA(10 pg)
  	特异性RNA(0.01 pg)
  2×NovoScript? All-in-one 1st Strand cDNA Synthesis SuperMix	10μl
  RNase Free Water	至20μl

• 可选优化步骤。如果RNA模板GC含量高或者含有二级结构，可先将模板和引物的混合液轻轻混匀，短暂离心，65℃孵育5分钟，冰上冷却。

• 轻柔混匀后离心。如果RNA模板中不含poly A结构，25℃先孵育5分钟，随后42℃孵育60分钟。

• 70°C加热5min终止反应。
  

  反应产物可直接用于PCR反应，如果不立即使用，在-20°C可保存一周左右。如想延长保存时间，建议使用-70°C 保存。

  
  

• 实时定量

  合成的第一链cDNA可直接用于PCR或qPCR。第一链cDNA反应液体积不能超过PCR反应体系的1/10。通常50 μl的PCR反应体系中，第一链cDNA反应液加入2μl。

  
  

• 用ROX Reference Dye I校准的Real Time PCR仪有：
  

  Applied Biosystems 5700/7000/7300/7700/7900/7900 HT/7900 HT Fast；Applied Biosystems StepOne/StepOne Plus；其他仪器。

• 用ROX Reference Dye II校准的Real Time PCR仪有：
  

  Applied Biosystems 7500/7500 Fast；Stratagene MX4000/MX3500P/MX3000P；其他仪器。

• 不需要用ROX Reference Dye校准的Real Time PCR仪有：
  

  Bio-Rad CFX96/CFX 384/iCycler iQ5/ iQ /My iQ5/MiniOpticon/Opticon/Opticon /Chromo4；Eppendorf MasterCycler realplex/ realplex 2s。Cepheid SmartCycler；Illumina Eco qPCR；Roche Applied Science LightCycler 480；Thermo Scientific PikoReal Cycler；Qiagen/Corbett Rotor-Gene Q/Rotor-Gene 3000/ Rotor-Gene 6000；其他仪器。

• 用DEPC处理实验用到的所有器材，或者购买已经证明无核酸酶的实验用具，整个实验过程需戴手套并经常更换手套，避免RNA酶的污染。

• 确保所用试剂中无RNA酶污染。

• 试剂盒如不使用，要严格密封保存。在反转录过程中，所有管盖要确保扣严。

• 纯化过的RNA要保证不含有盐，金属离子，乙醇和苯酚，因为以上成分会干扰第一链cDNA的合成反应。可采用乙醇沉淀法去除痕量污染物。