产品报价：180元
更新时间：2024/2/18 11:44:56
产地：美国
品牌：Yeasen
型号：11204ES03
厂商性质： 生产型,贸易型,服务型,
公司名称： 翌圣生物科技（上海）股份有限公司
翌圣生物科技（上海）股份有限公司 : (13916792673) (400-6111-883)
（联系我时，请说明是在来宝网上看到的，谢谢！）HieffTM qPCR SYBR? Green MasterMix
(Rox Provided Seperately)
产品信息
产品名称 | 产品编号 | 规格 | 储存 | 价格（元） |
HieffTM qPCR SYBR? Green Master Mix (Rox Provided Seperately) | 11204ES03 | 1 ml (40rxn(25μl/rxn)) | -20℃避光 | 180.00 |
11204ES08 | 5 ml (200rxn(25μl/rxn)) | -20℃避光 | 740.00 |
产品描述
HieffTM qPCR SYBR? Green Master Mix是2×浓缩的实时定量PCR扩增的预混合溶液，专为高特异性、高灵敏度实时定量PCR而设计。Mix中含有热启动的HieffTM DNA Polymerase，SYBR? Green I，dNTP Mix，Mg2+。使用时仅需在扩增体系中加入模板和引物即可进行实时荧光定量PCR，大大简化操作过程，缩短操作时间，降低污染。能有效抑制非特异性的PCR扩增，从而显著提高PCR反应的扩增效率，使定量PCR可以在宽广的定量区域内获得良好的线性关系。
本产品针对不同厂商的实时荧光定量PCR仪，分别提供不同浓度的Rox参比液（High Rox/Low Rox），用于矫正孔与孔之间的荧光信号误差。
产品组分
组分编号 | 组分名称 | 产品编号/规格 | |
11204ES03（1 ml） | 11204ES08（5×1 ml） | ||
11204-A | HieffTM qPCR SYBR? Green Master Mix | 1 ml | 1 ml×5 |
11204-B | High ROX* | 40 μl | 200 μl |
11204-C | Low ROX* | 40 μl | 200 μl |
*: 用以校正孔与孔之间产生的荧光信号误差。
High ROX适用仪器：ABI 5700、7000、7300、7900、7900HT Fast Real-Time PCR System、ABI StepOneTM、StepOne PlusTM
Low ROX适用仪器：ABI7500，7500 Fast Real-Time PCR System，ViiATM7，Stratagene MX3000P，MX3005P，MX4000，
QuantStudio?Dx，quant studio 6 Flex，quantstudio7 Flex
Roche, Bio-Rad的RealTime PCR仪不必使用ROX。
储藏与使用期限
本产品应置于-20℃避光储存；
尽量避免反复冻融，如每次使用量较少，推荐小份分装使用，有效期半年。
操作流程
1．上下颠倒混匀Mix，避免剧烈震荡以免产生过多气泡。Mix轻微离心后即可使用。
2．qPCR反应体系配制
试剂 | 体积1（50 μl） | 体积2（20 μl） |
HieffTM qPCR SYBR? Green Master Mix | 25 μl | 10 μl |
Primer 1（10 μM） | 1 μl | 0.4 μl |
Primer 2（10 μM） | 1 μl | 0.4 μl |
High/Low ROX | 1 μl | 0.4 μl |
模板DNA | X μl | X μl |
无菌蒸馏水 | Up to 50 μl | Up to 20 μl |
【注】：反应体系中各成分的量可根据以下原则自行调整：
1）反应体系中引物浓度一般在0.1-1.0 μM之间，一般引物终浓度为0.2 μM扩增效果较好；
2）cDNA模板的体积不要超过反应体积的1/10；
3）扩增产物长度请选择在100 bp-500 bp范围内，尤其推荐100 bp-200 bp之间；
4) qPCR灵敏度极高，建立反应体系时加入模板量的准确程度对最终定量结果会有很大的影响。因此如仪器允许，推荐您使用50 μl反应体系，并且将模板稀释后（如稀释至5μl/样本）加入反应体系中，这样可以有效提高实验的重复性。
3．PCR 反应条件
本实验以两步法程序为例，即退火/延伸设置在60℃。也可以用三步法进行PCR扩增反应。
【注】：HieffTM DNA Polymerase需要热激活处理以恢复酶活性，请至少设置PCR反应预变性条件为95℃ 5分钟。如果模板中GC含量较高，可将预变性时间延长至10分钟。
95℃ | 5 min | 预变性 |
95℃ | 10 sec | 循环反应（40 cycles） |
60℃ | 30-34 seca | |
95℃ | 15 sec | 融解曲线b |
60℃ | 60 sec | |
95℃ | 15 sec |
【注】：a:延伸时间需要根据定量PCR仪所需要的数据采集最短时间限制自行调整。
b: 融解曲线采集程序可根据您使用的Real Time PCR仪自行调整，通常情况下使用仪器默认程序即可。
4．反应结束后确认Real Time PCR的扩增曲线（图一）及融解曲线（图二），进行标准曲线制作等。也可用琼脂糖凝胶电泳确认PCR扩增产物特异与否。
图一扩增曲线
【注】：对于荧光定量而言，反应Ct值落在20-28之间定量最为准确。如果Ct值太小，请稀释模板后重新进行试验；Ct值大于35时，Real TimePCR检测无效，目标基因无表达；当Ct值介于32-35之间时，需要至少三个重复才能判断目标基因是否表达。
图二扩增产物融解曲线
【注】：如果反应特异性好，无非特异性扩增产物产生，无引物高级结构，则融解曲线应该是单峰曲线，此时定量结果有效；若融解曲线出现显著多峰，则定量结果无效，请优化条件重新进行定量实验。(引物设计不合理而导致的引物二聚体在融解曲线内峰值一般位于75℃左右，如该峰显著请更换引物再次实验)。
使用本品进行绝对定量需自行绘制标准曲线；进行相对定量可根据下述公式计算目标基因表达情况：
设定CtA1为1号样本目标基因Ct值，CtB1为1号样本内参基因Ct值；CtA2为2号样本目标基因Ct值，CtB2为2号样本内参基因Ct值，则1号样本和2号样本目标基因表达水平比值可粗略计算为（2-△△Ct法）：
△△Ct =（CtA2-CtB2）-（CtA1-CtB1）= X则2号样本内目标基因的表达水平为1号样本内的2 -X 倍。
注：上述计算方法是假定扩增效率为100% (每个循环过后产物量为前一循环产物量乘以2)，如实际过程中扩增效率不为100%，需根据实际扩增效率修改计算公式。例如：目标基因和内参基因扩增效率为0.90，则计算公式应该修正为(1+0.90)-△△Ct。
引物设计指南
1）扩增产物长度100bp-150bp为佳。重要！
2）引物长度17 bp-25 bp最好。太短的引物容易导致扩增效率降低，太长的引物会导致引物高级结构出现几率增加；
3）引物的3’端应尽量避免高GC或高TA含量区域；
4）引物3’端最后一个碱基最好为G或者C，避免使用T；
5）正向引物和反向引物的Tm值最好相差不要超过1℃。Tm值调整至60℃-65℃为佳。（引物Tm值推荐使用Primer 5进行计算）。
6）引物的GC含量控制在40%-60%之间，最佳为45%-55%；
7）引物A、G、C、T整体分布尽量要均匀，避免使用GC或者TA含量高的区域，尤其是3’端，必须避开GC含量不均匀的区域；
8）尽量避开T/C或者A/G的连续结构；
9）避开引物内部或者两条引物之间有3个碱基以上的互补序列，二条引物之间的3’端避开有2个碱基以上的互补序列；
10）引物设计完毕使用NCBI BLAST功能检索核对引物特异性，以避免非特异性扩增产生。
qPCR反应有效性确认标准
1）线性关系以及扩增效率确认：
标准曲线相关系数（R2）＞0.98
标准曲线斜率介于 -3～-3.5之间
PCR扩增效率（E）介于0.9～1.2之间。
2）重复性确认：
重复管之间的STD＜0.2
3）特异性确认：
扩增产物融解曲线无明显非特异性扩增产物/引物二聚体杂峰（必要时请进行琼脂糖电泳进行确认）。
相关产品
产品编号 | 产品名称 | 规格 | 价格(元) |
11201ES03 | HieffTM qPCR SYBR? Green Master Mix (No Rox Plus) | 1 ml (40rxn(25μl/rxn)) | 180.00 |
11201ES08 | HieffTM qPCR SYBR? Green Master Mix (No Rox Plus) | 5 ml (200rxn(25μl/rxn)) | 740.00 |
11202ES03 | HieffTM qPCR SYBR? Green Master Mix (Low Rox Plus) | 1 ml (40rxn(25μl/rxn)) | 180.00 |
11202ES08 | HieffTM qPCR SYBR? Green Master Mix (Low Rox Plus) | 5 ml (200rxn(25μl/rxn)) | 740.00 |
11203ES03 | HieffTM qPCR SYBR? Green Master Mix (High Rox Plus) | 1 ml (40rxn(25μl/rxn)) | 180.00 |
11203ES08 | HieffTM qPCR SYBR? Green Master Mix (High Rox Plus) | 5 ml (200rxn(25μl/rxn)) | 740.00 |
11204ES03 | HieffTM qPCR SYBR? Green Master Mix (Rox Provided Seperately) | 1 ml (40rxn(25μl/rxn)) | 180.00 |
11204ES08 | HieffTM qPCR SYBR? Green Master Mix (Rox Provided Seperately) | 5 ml (200rxn(25μl/rxn)) | 740.00 |
11205ES03 | HieffTM qPCR TaqMan Probe Master Mix | 1 ml (40rxn(25μl/rxn)) | 225.00 |
11205ES08 | HieffTM qPCR TaqMan Probe Master Mix | 5ml (200rxn(25μl/rxn)) | 740.00 |
11102ES50 | HieffTM First Strand cDNA Synthesis Kit | 50T | 510.00 |
11102ES72 | HieffTM First Strand cDNA Synthesis Kit | 5×50T | 2295.00 |
11103ES70 | HieffTM First Strand cDNA Synthesis Super Mix for RT-qPCR | 200T | 918.00 |
11104ES70 | HieffTM First Strand cDNA Synthesis Super Mix for RT-qPCR (+gDNA wiper) | 200T | 1038.00 |
