红色荧光标记鬼笔环肽PHDH1-A

Acti-stain^TM 555 FluorescentPhalloidin

红色荧光标记鬼笔环肽

产品信息

背景描述

鬼笔环肽是一种从鬼笔鹅膏中得到的有毒的环状七肽，可以与纤维肌动蛋白丝非常特异的结合，并且具有很高的亲和力。它能使肌动蛋白聚合物的临界浓度降低到小于1ug/mL，因此，常作为一种聚合促进剂使用。因此，常作为一种聚合稳定剂使用。该物质可以被红色荧光染料标记，从而作为标记物用于组织细胞培养、组织切片或无细胞系中的肌动蛋白标记。被Acti-stain^TM 555 phalloidin标记的肌动蛋白丝其生物学特性未发生改变，包括与肌球蛋白结合的能力。

Acti-stain^TM555phalloidin呈红色，固体，分子量1775。该化合物吸光度和荧光扫描显示分别在550nm和570nm有一吸收峰和荧光峰。其1 x 工作液即可对300-350张盖玻片的细胞进行染色。

注意：鬼笔环肽具有毒性，需小心操作（对人，其半数致死剂量为2mg/Kg）。

图1   Acti-stain^TM 555 fluorescentphalloidin的吸光度和荧光扫描图谱

说明：甲醇稀释标记的鬼笔环肽，对其吸光度和激发光谱分别在250-750nm和550-750nm处扫描，吸收峰为550nm，荧光峰为570nm。

运输与保存方法

冰袋（wet ice）运输。使用前简短离心使样品至管底，加入500μl无水甲醇配制成14uM的溶液。该溶液可在-20℃稳定保存6个月，冻干粉可以在4℃干燥环境（湿度<10%）下保存6个月。

产品应用

应用1：免疫荧光

目前有多种方法可用于组织培养细胞中的微丝染色，而染色过程中固定是获得良好效果的关键步骤，根据不同的要求有不同的固定方法。用多聚甲醛或者戊二醛的方法固定可以取得较好的染色效果。

试剂

1）    Acti-stain^TM555 phalloidin；

2）    半丰度的3T3细胞；

3）    F-肌动蛋白染色试剂盒（或按4-7配制溶液）；

4）    磷酸盐缓冲液（20mM,PH7.4, 150mM NaCl）；

5）    固定液（3.7% 多聚甲醛溶于PBS，pH调制7.0）；

6）    透化液；

7）    抗荧光淬灭封片液（FlukaBiohemika, Cat.#10981）;

8）    100nMDAPI（溶于PBS）;

9）    载玻片；

10）  盖玻片封口液。

图2 Swiss 3T3细胞中应力纤维图

备注：按照方法中的步骤利用Acti-stain? 555phalloidin对生长于玻璃盖玻片上的半丰度的3T3细胞进行染色，利用带有480Ex/535Em设备的荧光显微镜进行观察（CCD摄像机，40倍目镜），明显可见被染成红色的纤维蛋白丝。

设备

1）  荧光显微镜。

2）  数字CCD照相机。

方法

1）  于盖玻片上培养组织细胞至半丰度；

2）  100nMActi-stain^TM555 phalloidin工作液的准备，即吸取3.5μl 14μM 的Acti-stain^TM555 phalloidin的标记储存液于500μl PBS，室温避光保存。

3）  移除培养基，于37℃利用PBS轻轻洗涤培养细胞一次；

4）    利用固定液室温固定细胞10min。

5）    PBS室温洗涤细胞30s；

6）    室温透化细胞5min；

7）    PBS室温洗涤细胞30s；

8）  将盖玻片移至一张封口膜上，于潮湿的环境下加入200μl 100nM Acti-stain^TM 555phalloidin，室温避光孵育30min。

9）    PBS洗涤盖玻片3次；

10）  200μl 100nM DAPI复染DNA30s；

11）  PBS冲洗盖玻片，翻转将其放置于滴有荧光猝灭液的载玻片上，用纸巾吸除多余液体。

12）  4 ℃避光保存上述载玻片；

13）  典型的F-肌动蛋白染色结果如图2.

应用2：稳定荧光微丝的制备

在肌球蛋白马达蛋白的研究中，稳定的微丝对于肌动蛋白的能动性分析是一个很好的底物。Acti-stain? 555phalloidin的结合不会影响肌球蛋白ATP酶对肌动蛋白的激活作用。

试剂

1）    肌动蛋白（250μg）；

2）    常用肌动蛋白缓冲液(5mMTris-HCl pH8.0, 0.2mM CaCl₂)；

3）    10x聚合缓冲液(500mM KCl,20mM MgCl₂,10mM ATP)；

4）    Acti-stain?555Phalloidin。

设备

荧光显微镜；数字化CCD照相机。

方法

1）  配制具有0.2mM ATP 和1.0mM DTT的肌动蛋白缓冲液，取250μl重悬兔肌肉肌动蛋白。混匀，冰浴1h；

2）    加入1/10体积的聚合缓冲液室温聚合肌动蛋白1h；

3）  取2.5μl 14μM Acti-stain? 555phalloidin于500μl聚合缓冲液中，混匀，利用该溶液100倍稀释聚合的微丝；

4）    滴1滴抗荧光猝封液于载玻片上，吸取1μl标记的肌动蛋白于上述抗荧光猝灭封片液中；

5）    盖上盖玻片，吸除多余液体；

6）    显微镜观察，微丝呈2-10μm的长度，4℃避光可以稳定保存一周。

产用使用

1）用于固定的组织切片、组织培养细胞中微丝的荧光染色。注意:不像一些肌动蛋白抗体，Acti-stain?555Phalloidin仅与F肌动蛋白丝结合，从而降低了荧光背景。另外，该染料的结合没有物种差异。

2）体外稳定的荧光微丝的制备。

参考文献

1.  Fluorescen dye is sold under license fromAnaspec.