RhodaminePhalloidin罗丹明标记的鬼笔环肽PHDR1

RhodaminePhalloidin罗丹明标记的鬼笔环肽

产品信息                                                      

背景描述

鬼笔环肽是一种从鬼笔鹅膏中得到的有毒的环状七肽，可以与纤维肌动蛋白丝非常特异的结合，并且具有很高的亲和力。它能使肌动蛋白聚合物的临界浓度降低到小于1μg/mL，因此，常作为一种聚合促进剂使用。该物质可以被罗丹明染料标记，从而作为肌动蛋白抗体替代物广泛用于组织细胞培养、组织切片或无细胞系中的肌动蛋白标记。被罗丹明标记的肌动蛋白丝其生物学特性未发生改变（包括与肌球蛋白结合的能力）。

罗丹明标记的鬼笔环肽呈粉色，固体，分子量1306。其1 x 工作液即可对300-350张盖玻片的细胞进行染色。

注意：鬼笔环肽具有毒性，需小心操作（对人，其半数致死剂量为2mg/Kg）。

运输与保存方法

室温运输。使用前简短离心使样品至管底，加入500μl无水甲醇配制成14um的溶液。推荐将其溶液分装成10×50μl份于-20℃避光保存，按照这种方法可稳定保存6个月，冻干产物可以在4℃干燥环境（湿度<10%）下保存1年。

产品应用

应用1：免疫荧光

目前有多种方法可用于组织培养细胞中的微丝染色，而染色过程中固定是获得良好效果的关键步骤，根据不同的要求有不同的固定方法。用多聚甲醛或者戊二醛的方法固定可以取得较好的染色效果。

试剂

1）    罗丹明标记的鬼笔环肽；

2）    半丰度的3T3培养细胞；

3）    F-肌动蛋白染色试剂盒（或按4-7配制溶液）；

4）    磷酸盐缓冲液（20mM,PH7.4,150mM NaCl）；

5）    固定液（3.7% 多聚甲醛溶于PBS，pH调制7.0）；

6）    透化液；

7）    抗荧光淬灭封片液（FlukaBiohemika, Cat.#10981）;

8）    100nMDAPI（溶于PBS）;

9）    载玻片；

10）  盖玻片封口液。

图1 经罗丹明鬼笔环肽标记的Swiss3T3细胞中应力纤维图

备注：按照方法中的步骤利用Rhodaminephalloidin对生长于玻璃盖玻片上的半丰度的3T3细胞进行染色，利用带有480Ex/535Em设备的荧光显微镜进行观察（CCD摄像机，40倍目镜），明显可见被罗丹明鬼笔环肽染成红色的纤维蛋白丝和被DAPI染成蓝色的细胞核。

设备

1）荧光显微镜。

2）数字CCD照相机。

方法

1）    于盖玻片上培养组织细胞至半丰度；

2）  100nMRhodaminephalloidin工作液的准备，即吸取3.5μl14μM 的Rhodaminephalloidin的标记储存液于500μl PBS，室温避光保存。

3）    移除培养基，37℃下利用PBS轻轻洗涤培养细胞一次；

4）    利用固定液室温固定细胞10min。

5）    PBS室温洗涤细胞30s；

6）    室温透化细胞5min；

7）    PBS室温洗涤细胞30s；

8）  将盖玻片移至一张封口膜上，于潮湿的环境下加入200μl 100nM Rhodaminephalloidin，室温避光孵育30min。

9）    PBS洗涤盖玻片3次；

10）  200μl 100nM DAPI复染DNA30s；

11）  PBS冲洗盖玻片，翻转将其放置于滴有荧光猝灭液的载玻片上，用纸巾吸除多余液体；

12）  4 ℃避光保存上述载玻片；

13）  典型的F-肌动蛋白染色结果如图1。

应用2：稳定荧光微丝的制备

在肌球蛋白马达蛋白的研究中，稳定的微丝对于肌动蛋白的能动性分析是一个很好的底物。Rhodaminephalloidin的结合不会影响肌球蛋白ATP酶对肌动蛋白的激活作用。