美国Refine ATF系统|细胞截留设备

美国Refine TECHNOLOGY 成立于1999年，从成立至今一直追求通过细胞悬浮培养如何达到细胞或产物产量达到质的飞跃。公司成立没多久，refine申请了专利—ATF system，目前该系统已经被应用于很多生物制药行业的生产当中。

ATF system 可以帮助您....
改进您的工艺
显著提高细胞密度
提高细胞及产物产量

概述

Refine Technology专注于利用细胞分离系统增加细胞表达量。公司成立后推出了ATF™系统，目前该系统已被广泛应用于生物制药行业研发与生产领域，ATF™系统已在细胞连续培养、细胞库建立、病毒生产以及细胞微载体培养等方面取得了非常成功的应用。

ATF™系统旨在增加细胞产量，它提供更加可靠和更加有效的工艺进行细胞分离，使得细胞可以达到极高密度。ATF™系统能增加单位体积产率，这样，即使您使用小规模生物反应器，也能得到与大规模生物反应器同样的产量。ATF™系统支持1-1000L传统型或者一次性生物反应器，能应用于培养包括贴壁细胞在内的几乎所有细胞系。

原理

ATF™系统的核心部分是以压缩空气为驱动力的隔膜泵，空气流交替进出该隔膜泵底部使得培养液在生物反应器和系统间快速循环，培养液在经过中空纤维切向流过滤后，实现细胞拦截。

系统快速的培养基交换速率和低剪切力保证了培养体系内细胞的极高密度及活力。ATF™系统每循环一次（10s-15s），滤器便得到一次反冲洗，这种特有的脉动反冲过滤技术使得细胞密度即使达到10⁸个/ml时，也能有效防止滤器阻塞。

ATF™系统独有优势

v  极高细胞密度（悬浮细胞培养密度能达到2×10⁸个/ml）；

v  高蛋白产量（灌流培养>1g/L/day，补料批次培养有报道达到17g/L）；

v  快速培养基交换（>1vv/h)

v  维持良好的细胞培养环境，保证细胞状态优秀，从而得到品质如一的产品

v  低剪切力，无细胞损伤

v  最大限度简化人工操作

v  快速启动生产，缩短生产周期

v  应用广泛，可应用于从细胞库建立、大规模细胞培养的上游生产至下游纯化。

v  易于放大生产，适用于1-1000L生物反应器使用

v  适于任何种类的细胞（包括贴壁细胞）

选择ATF system的理由：
培养悬浮细胞（如CHO 或 PER.C6®）密度可以达到4-15×107个/ml；
蛋白产量1g/L/day甚至更高；
保证细胞状态优秀，这样，可以得到品质如一的产品；
快速交换或移除培养基（≥1vv/hr）；
剪切力小，对细胞无损害；     

独一无二的ATF-system

ATF系统的独特之处在于它的运作流程，系统的核心部分是以可控制流量的经过滤后的空气为驱动力的隔膜泵。空气流交替进出隔膜泵底部使得培养基可以在生物反应器和ATF系统间进行循环。每经历一次10-15秒的循环都会使得滤器得到反冲，这样的反冲效应在即使细胞密度达到108个/ml级时也能阻止滤器阻塞，这也是ATF系统独特的防滤器阻塞技术。

适用于各种规模生物反应器

目前证实可被应用的领域：

浓缩补料批次培养（Concentrated Fed-Batch,CFB)；

高产率细胞连续培养；
    病毒生产和过滤；
    XD™工艺；
    快速移除和更换培养基；
    纯化和收获；
    浓缩细胞和产品；
    高密度细胞库以及快速开始生产；
    高密度种子转移以及减少种子驯化步骤；
    微载体工艺培养细胞时冲洗、灌流、渗滤、培养基交换以及细胞分离。

详细应用介绍：

A、新型上游工艺生产模式（New Manufacturing Platform -Upstream）

v   ATF-细胞库的建立—没有复杂的人工操作步骤，轻松建立高细胞密度种子库

细胞库建立通常是很繁琐的人工操作过程，包括利用离心机进行的一系列浓缩、分离以及重悬等操作过程，操作时间长而且复杂，所以常常具有较大的批间/批内差异。

由于细胞培养的第一步是细胞复苏，因此冻存管中的细胞对生产和科研都显得尤为重要。生产上通常采取的方法是复苏多支细胞后，再经过一系列的平行细胞扩增，选择最好状态的细胞接种到一级生物反应器内。这种繁琐的操作方法是由于人工冻存细胞时的批间/批内差异导致，因此无法避免。在传统方法操作步骤中，通常存在风险、不确定性，最重要的是，花费了大量宝贵的时间。
ATF-细胞库建立能解决这些问题。该解决方法的基础是细胞在生物反应器内总是可以处于健康的环境，在生物反应器内，细胞可以避免因离心带来的缺氧、营养物缺乏等问题。细胞库建立时，更换培养基以及添加冻存液都在生物反应器内迅速进行，并且细胞很快转移至一次性冻存袋中，不需要任何人工操作，整个过程可以在一小时内自动完成，而且能保证所有冻存袋内的细胞状态一致。

v  ATF种子扩增—快速启动生产，极大缩短生产周期

建立好细胞库后，细胞不需要预先进行离心去除DMSO等操作，可以直接接种至小型生物反应器内，该小型生物反应器规模主要取决于设备（一次性或者传统型），可以为5-50L或者更大规模， 种子如果以浓缩补料批次培养（CFB）工艺进行扩增可以达到极高的细胞密度（7-15×107个/ml）。这样，由于不需要额外的中间放大步骤，一级种子罐可以是大型生物反应器(20-50x)，这样，不仅节省了大量的时间和资金，而且降低了每批次的生产风险。而大型的应用于生产的生物反应器可以采取传统的批次或补料批次培养模式，如果想努力取得更高产量，可以进行浓缩灌流培养（CP）或者CFB培养工艺。

v  灌流培养-ATF系统最大程度使得工艺变得简单

当产物蛋白稳定性差、细胞株表达量低时，灌流培养工艺被认为是最合适、最经济的工艺。但由于复杂的不可靠的设备，使得灌流培养工艺吸引力大大减弱，并且这种工艺的优化过程以及设备操作常常让人觉得极其复杂。

现在，ATF系统不仅可以很好解决这些问题，而且可以最大程度使得工艺变得简单，甚至比补料批次培养工艺更简单。

同时，利用ATF系统可以达成浓缩灌流培养，浓缩灌流培养的主要特点包括：

●  极高的细胞密度（7-20×10⁷个/ml）

●  细胞活力在90%以上

●  1-3vv/天培养基

●  单细胞悬浮状态，无结团

●  和原有灌流培养工艺控制一样简单，但是具有更高的产量

●  可以仅仅用于为了获得更高细胞密度—比如用于ATF-细胞库建立。

浓缩灌流培养工艺只有利用ATF系统才能完成，利用其它系统都不能达到相同的效果。

v  浓缩补料批次培养（CFB，Concentrated Fed-Batch）

这是一种令人激动的细胞培养平台技术。对比补料批次培养工艺，它能得到更高的细胞数和产物浓度。补料批次培养工艺在世界范围内的生物制药行业得到广泛应用，这是一种稳定的平台技术并具良好的重复性。但是，来自工业上的挑战（同一适用症药物竞争、降低生产成本等）使得需要更多新的选择。CFB工艺为制药工业提供了一个极好的选择。已有报道称，将CFB工艺用于CHO细胞培养，可以使得产物表达量达到17g/L，而且在其它细胞系中表达量甚至会更高。

v  微载体培养—简化微载体培养复杂工艺的每个环节，并使得这些操作步骤更加可靠

微载体培养细胞工艺比CFB和补料批次培养更加复杂。一般有：清洗、浓缩、灌流、快速更换培养基、胰酶消化、清洗、细胞-微载体分离、病毒灌流、病毒收获。对比CFB和补料批次工艺，多出的步骤包括罐的准备、多次清洗步骤，这也意味着需要大量人工操作，以及存在多个潜在污染点。

ATF系统能简化利用微载体培养贴壁细胞（如Cytodex）的工艺并使得这些步骤更加可靠，从清洗灭菌后载体、灌流、细胞-微载体分离到最终产物收获,ATF系统都能发挥极大作用。使用ATF系统能自动化所有工艺步骤。应用微载体培养细胞，规模在1-5000L都可以使用ATF系统。

B、下游

v  培养液收获—不需要使用离心机，提高收获速度（3-4倍）

ATF系统的快速培养基交换速度在此步骤会发挥明显优势。常规方法在很顺利的情况下，操作者能在3-4h内浓缩50L 2-20×107个/ml细胞密度。ATF系统通过流线型化操作简化了生产工艺研发，使达成结果速度提高3-4倍。利用ATF系统得到的收获液可以直接进行下游纯化。由于降低了对细胞的人工操作，因此也减少了各种风险。这样，投资成本以及总成本都得到降低。

v  病毒清除、蛋白浓缩等

ATF系统已经开始应用于取代其他类型过滤设备。在一定条件下，能得到非常好的结果。