高纯度质粒DNA大量提取试剂盒（10次）
产品用途
常规限制性酶切
PCR扩增
转化
DNA序列测定
体外转录
质量控制
从大肠杆菌提取pGEM质粒DNA。提取的质粒DNA质量通过琼脂糖凝胶电泳、限制性酶切和序列测定分析。
质粒DNA提取流程图
图1 质粒DNA纯化流程图
操作方法
1 收集100 ml菌液。8,000 rpm离心5min，弃上清。尽量吸除上清，为确保上清液全部吸取，请倒置干净的吸水纸上。
注：应根据所培养菌体的浓度与拷贝数确定收集的菌液量。如果菌液浓度过低或低拷贝质粒，可收集2次100 ml菌液，并将菌体沉淀收集到一个离心管中。菌体的体积与质
粒拷贝数参见注意事项。
2 加入7.5 ml溶液Ⅰ/ RNase A混合液，漩涡剧烈振荡直至菌体重新悬浮。室温静置5-10min。
注：初次使用本试剂盒时，请将RNase A全部加入到溶液Ⅰ中，均匀混合后于4℃保存。可保存6个月。
不要残留细小菌块。菌液重新悬浮充分与否将决定质粒DNA的得率。
室温静置5-10min是为使溶液中的RNA被充分降解。
3 加入7.5 ml溶液Ⅱ，轻柔地反复颠倒混匀12次。室温放置3-5min，使菌体充分裂解，直至形成澄清的裂解溶液。
注：若溶液Ⅱ出现沉淀，请于37℃保温溶解，待恢复至室温后使用。沉淀的出现不会影响质粒DNA的纯化结果。
加入溶液Ⅱ后，不可剧烈混和，否则会使染色体DNA断裂。此时菌液应变得清亮粘稠，如果未变得清亮，可能由于菌体过多，裂解不彻底，应减少菌体量。
4 加入10 ml溶液Ⅲ。立即轻柔地反复颠倒混匀6-10次，此时会出现白色絮状沉淀。
注：加入溶液Ⅲ后，应立即混匀避免产生局部沉淀。
5 12,000 rpm室温离心12min，收集上清。
6 将上清置于DNA纯化柱中，静置5min。
注：如果收集的上清液过多，超过DNA纯化柱容积（15 ml），可将上清分次加入DNA纯化柱中。
7 12,000 rpm 离心2min，弃滤液。
注：此时质粒DNA被吸附于DNA纯化柱中的硅胶膜上。
8 加入10 ml 溶液PB。12,000 rpm 离心2min，弃滤液。
注：此步骤的作用是将硅胶膜上吸附的蛋白、盐等杂质洗脱，以获得高质量质粒DNA。
9 加入10 ml溶液W。12,000 rpm 离心2min，弃滤液。
10 加入10 ml溶液W。12,000 rpm 离心2min，弃滤液。
11 12,000 rpm离心4min，以去除纯化柱中残留的液体。打开纯化柱的管盖，室温放置5min，将纯化柱充分晾干。
注：此步骤的作用是去除残余酒精，避免降低质粒的生物学活性，影像下游酶促反应。
12 将DNA纯化柱置于新的50 ml离心管中。向纯化柱中央处，悬空滴加1.5-2 ml溶液Eluent（65℃预热），室温放置5min。12,000 rpm离心2min。管底即为
高纯度质粒DNA。质粒DNA置于-20℃保存。
注：溶液Eluent可用无菌双蒸水代替，但其pH需为8.0-8.5，加入体积视质粒拷贝数多少、用户对质粒浓度要求而定。
对溶液Eluent 65℃预热，会提高提取质粒的
产量。
图2 质粒DNA电泳图
注意事项
1 提取的质粒量与细菌培养浓度、质粒拷贝数等因素有关。如果所提质粒为低拷贝质粒或大于10 kb 的大质粒，应加大菌体使用量。高拷贝质粒推荐使用
量为100ml，得率一般在0.5 mg~1.5 mg 左右；低拷贝质粒推荐使用量为200ml，得率一般在200~400μg。溶液Eluent 应在65℃水浴预热，在吸附和洗脱时
可以适当的延长时间，以增加提取效率。其它步骤相同。
2 所有离心步骤均为使用常规台式离心机室温下进行离心，速度为12,000 rpm（约13,400×g）。
3 所有离心步骤均为使用常规台式离心机室温下进行离心，速度为12,000 rpm（约13,400×g）。
4 溶液 Eluent（10 mM Tris-HCl, pH 8.5）中不含EDTA，其收集的DNA片段可直接用于各种酶促反应等，不会影响后续试验。
质粒DNA浓度与纯度检测
1 利用紫外分光光度计检测时，OD260值为1 相当于大约50 μg/ml 双链DNA。高纯度的质粒DNA OD260/280通常在1.7-1.9 左右。如果洗脱时不使用洗脱缓冲
液，而使用去离子水，比值会偏低，但并不表示纯度低，因为pH 值和离子存在会影响光吸收值。
2 利用琼脂糖凝胶电泳检测时，理想情况是只出现单一超螺旋条带。然而，再质粒提取过程中，由于机械剪切、酸碱度等原因，使质粒DNA发生断裂。电
泳时可能出现1-3条带，电泳迁移率从大到小，分别为超螺旋质粒、开环质粒或复制中间体。但是，只要质粒DNA经过单酶切鉴定后（单酶切位点），呈现
单一条带，就表明没有基因组DNA的污染。
