在扩增或制备复制缺陷型腺病毒时会产生复制型腺病毒（replication competent adenoviruses，RCA），RCA是因为重组腺病毒的基因组与293基因组的E1同源序列间发生重组而产生的。这就导致目的基因丢失而被E1区代替。具体表现是在本不支持病毒载体复制的细胞株（如A549细胞）上产生病毒的复制和扩增。实验证明，复制型腺病毒(RCA) 数量随着腺病毒载体在293细胞上的传代次数的增加而增加。RCA在其宿主细胞中可以自主复制和扩增，因此RCA的产生会严重干扰重组腺病毒载体的使用效果和带来安全隐患。

由于腺病毒转染进293细胞中繁殖时，通过同源重组重新出现复制型腺病毒(Replication-competent Ads，RCAs)。虽然现在已经发展到第三代腺病毒，但是仍然存在一定的RCA现象。Cell BioLabs的Rapid Replication Competent Adenovirus（RCA） Assay Kits（目录号：VPK-111）使用免疫印迹的方法，通过计数感染细胞计数和公式运算以确定RCA。

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