Izon公司纳米粒度检测技术

默瑞生物是美国Izon公司的中国授权总代理商，欢迎大家咨询订货。
　　默瑞热线：4006-400-850
　　售前咨询：info@moreybio.com
　　产品订购：order@moreybio.com
　　售后支持：tech@moreybio.com
　　默瑞官网：www.moreybio.com　　
Izon qEV 柱从生物样品中分离细胞外囊泡。

　　适用于 qEV 的样品 1

　　• 血清

　　• 血浆

　　• 唾液

　　• 尿

　　• 细胞培养液

　　选用 Izon qEV 柱的优势包括 2

　　• ～15 分钟的分离时间

　　• 极大程度地降低蛋白复合物产生和囊泡聚集的风险

　　• 可以使用生理等渗的缓冲溶液

　　• 是一种温和、快速的方法，可以最大程度地维持囊泡的生物学功能

　　• 囊泡回收率为 50%或更高

　　• 蛋白的去除比>1000 倍

　　• HDL 纯化>8 倍

　　说明书

　　样品体积 ≤1 mL， 500 μL 为获得最高纯度 EV 的优化体积

　　空隙体积 3.0 mL ± 0.25 mL

　　操作温度 15 至 25 °C

　　流速 在 18°C 时通常为 0.8 至 1.2 mL/min

　　分离尺寸 70 nm

　　缓冲液 PBS

　　床层体积 10 mL

　　最大可通过尺寸 1 μm

　　顶部和底部过滤尺寸 20 μm

　　纯化 pH 范围 3-13

　　清洗 pH 范围(CIP) 2-14

　　保质期 3 个月(适当保存)

　　第一次使用后的寿命 取决于使用方法与保存方法

　　1 注意有些“原始”样品未经处理不得直接用于 qEV 柱或 TRPS 分析，需要进行至少两次样品离心(例如血、唾液)或浓缩(细胞培养液)。从 Contact support@izon.com 获得有关操作步骤的帮助。

　　2 A.N Böing et-al; “Single-step isolation of extracellular vesicles by size-exclusion chromatography”, Journal of Extracellular Vesicles 2014, 3: 23430

　　1

　　qEV 技术手册 WWW.IZON.COM

　　安全预防

　　• 当使用 qEV 柱时采取适当的个人防护措施，比如实验服，手套和防护镜。

　　如下图所示：

　　• 将柱子固定，使液面水平(确保柱子垂直)

　　• 不要移除底部滑动盖

　　• 小心缓慢地移去顶盖

　　3qEV 尺寸排阻柱只用于研究目的。

　　April 2016

　　柱子的平衡

　　• 移除底部滑动盖，并且使用至少 10 mL 洗脱缓冲液(PBS)冲洗柱子。如果不是使用 PBS 洗脱，那么至少使用 30 mL 洗脱缓冲液冲洗柱子。记下 5 ml 缓冲液通过尺寸排阻柱通过的时间，这可用于判断何时需要清洗柱子。

　　• 确认有充分的平衡时间使柱子温度介于操作温度范围内。

　　• 不要使柱子变干。顶部的筛板必须保持湿润。柱子变干会影响其功能。

　　• 使用当天新配的过滤(0.2 μm)缓冲液避免引入颗粒物污染。

　　• 为了最好的结果，建议购买 Izon Prep and Reagent 试剂盒。

　　• 如果在操作温度范围之外使用，可能会得到错误的结果。

　　样品的纯化

　　1.样品的引入的应用

　　1. 在柱子移除底部滑动盖之前，用移液枪移除筛板顶部的缓冲液。

　　2. 加入 500 μL 样品。

　　3. 立即移去底部滑动盖。

　　4. 立即开始收集 0.5 mL 馏分;

　　• 最开始的六个馏分(3.0 mL)是空隙体积，不包含囊泡，通常无需分析。

　　• 建议将空隙体积收集在同一个收集管中

　　来节约时间，并可避免 6 个单独的管子带来的测量误差。

　　5. 当最后的样品刚刚进入柱子顶部筛板(与之相平)，加入更多的缓冲液，但是不要高于顶部筛板 2 mL。

　　• 等待直到最后一滴样品刚刚进入柱子顶部筛板，避免样品稀释。

　　2. 样品馏分收集

　　当依据操作流程使用 qEV 柱时，EVs 大多数洗脱于馏分 7、8 和 9 中，去除了～99.8 %的蛋白;

　　2

　　qEV 技术手册 WWW.IZON.COM

　　大于 10 的馏分包含更多的蛋白和更少的囊泡，不建议分析。为了得到更高的 EV 回收率，馏分可以合并起来，但是，合并馏分会稀释 EVs 的浓度。

　　方法 A — 得到最高的纯度和浓度不同的样品会得到不同的洗脱峰形，因此建议

　　预先测量 EV 浓度并对所有馏分(7 - 11)进行蛋白纯化。

　　1. 空隙体积之后立即收集 3 个囊泡馏分，每个馏分 500 μL(馏分 7、8 和 9)。

　　2. 测量每个馏分的 EV 浓度(使用 Izon qNano)和蛋白纯度。

　　• 为了得到高浓度囊泡，使用最高 EV 浓度的馏分(通常 7 和 8)。注意：合并馏分会稀释 EV 浓度。

　　• 为了得到高纯度囊泡，使用最低蛋白浓度的馏分。

　　方法 B — 一般使用操作空隙体积之后立即收集一个囊泡馏分，1500

　　μL。为了减少蛋白污染，建议只收集 1000 μL。

　　3. 囊泡收集后

　　当收集完囊泡馏分之后，用至少 10 mL 缓冲液冲洗柱子，并按照《保存》部分的要求保存柱子。记下 5 ml 缓冲液通过尺寸流过尺寸排阻柱所需要的时间，这对于检测何时清洗柱子很有用。流速的改变可能暗示柱子被堵住或被污染。

　　qEV 柱的维护

　　再次使用

　　如何检测柱子何时被污染并需要清洁;

　　• 流速相比初始流速开始变缓。因此建议测量初始冲洗流速(和/或空隙体积)作为对比。

　　April 2016

　　• 如果较先前相似的样品来说回收率明显下

　　降，那么期望的 EVs 产率也相应下降。如果是这样，使用 Izon CPC100 校正颗粒(稀释于 PBS 缓冲溶液中)，收集馏分并使用 qNano 测量至少 2000 个数。两个峰值馏分的回收率应该>50%。

　　• 在冲洗完后，柱子顶端有颜色的变化。

　　注意

　　• 对于新的柱子和干净或再生的柱子，顶盖和凝胶表面之间的空间说明储存过程当中凝胶有所沉降，并不影响其性能。为了使样品的稀释影响最小化，可以将顶盖向下推动<2 mm。

　　• 当囊泡馏分随后被用于 PCR 或 RT-PCR 时，建议柱子单次使用。

　　柱子的再生

　　通常使用 20 到 30 mL 缓冲液清洗柱子，随后使用新缓冲液平衡柱子(如果更换环境)。

　　在一些应用中，变性的蛋白或脂质不会在再生步骤中被洗脱下来。可以通过下面的清洗步骤来去除。

　　柱子的清洗

　　去除沉淀蛋白、非特异性吸附蛋白和脂蛋白

　　用 10 mL 0.5 M NaOH 清洗柱子，然后用至少 30

　　到 50 mL 缓冲液冲洗柱子，并检查洗脱溶液

　　pH。

　　去除强非特异性吸附蛋白、脂蛋白和脂质

　　用 20 mL 非离子型表面活性剂溶液，如 0.1 %

　　Triton X-100 清洗柱子，然后用至少 20 到 30

　　mL 缓冲液冲洗柱子。

　　3

　　在某些情况下，一些样品仍会残留痕量蛋白。在清洗结束时再次检查蛋白含量，如果蛋白水平高于预期，再清洗一次。

　　柱子的消毒

　　消毒可以最大程度减少凝胶的微生物污染。用

　　10 mL 0.5 M NaOH 清洗柱子。然后用 30 到 50 mL 无菌缓冲液平衡柱子，并检查洗脱溶液

　　pH。

　　注意

　　• 脱气缓冲液有助于避免凝胶基质中气泡的

　　产生。少量的气泡(<10)对柱效影响极小。

　　• 建议使用 0.15 M 或更高离子强度的缓冲液，以避免溶质与凝胶基质之间产生不必要的离子相互作用。

　　• 为了避免尺寸排阻柱的堵塞，建议过滤或低速离心生物样品以去除大颗粒物。

　　普通 EV 来源的样品准备步骤

　　普通 EV 样品的应用手册和操作步骤见www.izon.com。如果不确定如何准备样品，请

　　联系技术支持 support@izon.com。

　　柱子的性能指标

　　囊泡的峰值洗脱

　　• 对于 500 μL 的样品体积，囊泡的洗脱峰值在 4.0 mL ± 0.5 mL。

　　• 两个峰值馏分的回收率大约 50 %。

　　• 对于 500 μL 的样品，峰值馏分通常在馏分 8 和 9 之中。如果希望更高的纯度，可以只收集最早的峰值馏分。

　　April 2016

　　通过测定 280 nm 处的紫外吸收可以得到 qEV 柱的蛋白洗脱图。通过 Bradford 法可以准确测定每个馏分中蛋白的精确含量。图 1 展示了当 500 μL 血浆样品上样至柱上时的囊泡洗脱图。每个馏分的囊泡浓度通过 qNano 测量，蛋白含量通过 280 nm 处的吸收值来测量。

　　图 1. 典型的 qEV 柱的洗脱图;蛋白洗脱的馏分晚于囊泡洗脱的馏分。

　　囊泡的富集是十分明显，它们主要存在于馏分7、8 和 9 中。血清蛋白的洗脱更慢一些，主要存在于馏分 11 - 30 中。大于 10 的馏分通常含有高浓度的蛋白和低浓度的囊泡，不建议用来做分析。

　　EVs 的洗脱始于馏分 7，馏分 8 和 9 的浓度达到最高。收集越多的馏分，EVs 的总回收率越高。

　　图 2 血浆中 EVs 的回收率说明了这点。但是，收集的馏分越多，EV 的回收浓度就会越稀释。见表 1。

　　4

　　图 2. 用 CD61 生物标志物测量的累积 Evs 回收率。误差条表示标准偏差。

　　上样体积

　　上样体积越大，囊泡馏分中的囊泡纯度越低。图 3 展示了血清上样体积为 100 μL，500 μL 和 2000 μL 时的囊泡分布。2000 μL 的样品导致囊泡最大程度地被蛋白污染。2000 μL 样品中外泌体的出峰延迟显而易见。

　　图 3. 血清上样 100 μL 至 2000 μL 的囊泡洗脱图。

　　为了得到更纯的 qEV，建议最佳的样品体积为 100 μL 至 500 μL，这样囊泡会洗脱于馏分 7 至 9 之中。

　　图 4 展示了血清上样体积为 100 μL 和 500 μL 时的囊泡洗脱图。

　　April 2016

　　图 4. 血清上样为 100 uL 和 500 μL 时的囊泡洗脱图。囊泡的尺寸分布为 70− 300 nm。

　　囊泡的损失发生在当样品体积大于 500 μL 时，囊泡的洗脱峰很宽以至于一些囊泡从馏分 11 中被洗脱下来。这些馏分不建议用来分析因为包含了大量的干扰蛋白。

　　纯化

　　图 5 展示了馏分 7 到 9 之间含有很少量的蛋白，且越后面的馏分中蛋白含量越多。

　　图 5. 馏分中蛋白含量占起始蛋白含量的百分比，误差条是七个柱子中测量蛋白含量的标准偏差。

　　图 6 展示了经过 qEV 柱纯化后，EVs 相对于蛋白的纯化度。每个馏分的纯化因子(纯化前后蛋白的减少比例)如图所示。馏分 7 和 8 富集

　　的 EVs 最多，也就是相对于回收的囊泡来说大部分蛋白被除去。