牛结核γ-干扰素ELISA试验操作规程

1. 简介

1.1 适用范围

    本试验用于检测牛全血培养上清中的牛γ-干扰素，根据检测牛PPD、禽PPD和PBS刺激全血后上清中γ-干扰素量的不同，从而判断牛结核的感染情况。

1.2 试验背景

牛γ-干扰素试验是以刺激培养全血为基础，检测牛结核病的一种试验方法。通常，感染分支杆菌的牛，其血液中的淋巴细胞能识别特异的分支杆菌抗原（包括结核菌素PPD），淋巴细胞识别分支杆菌抗原的过程涉及细胞因子的产生和释放，γ-干扰素就是其中最重要的一种。用结核菌素(PPD)刺激培养牛全血，全血中的T淋巴细胞就会识别PPD，发生细胞免疫反应，其中一个直接的表现就是产生并释放γ-干扰素。γ-干扰素可用γ-干扰素特异的单克隆抗体夹心法检测。

其它资料背景参考《牛γ-干扰素ELISA检测试剂盒》的说明书。

2. 安全性

2.1 所有操作步骤都应符合当地的“危险物质控制规范”

2.2 此试验存在一定风险，尽管风险比较小。阳性反应的上清中可能会含有分支杆菌，因此所有操作步骤都应遵循下面的操作规程。

3. 材料

3.1 试剂

牛γ-干扰素ELISA检测试剂盒(青岛瑞尔生物技术有限公司提供)，灭菌的去离子水（溶解试剂盒内物质）。

3.2 试验耗材

    1ml与200µl吸头（无菌）、生物安全口罩、高压灭菌袋、乳胶手套、消毒剂、记号笔、吸水纸、便签纸。

3.3 仪器设备

酶标仪（含450nm）、单道移液器（0-1000µl，0-200µl）、8-12多道移液器、移液槽、振荡器、计时器。

4. 操作程序

4.1 试剂准备

4.1.1 ELISA板

    未开封前，在室温平衡至少1小时。

4.1.2 阴阳性对照

    用无菌蒸馏水或去离子水溶解，确保完全溶解，溶解后的阴阳性对照可在2-8°C保存3个月。使用前恢复至室温，并充分混匀。

4.1.3 洗液

    使用前恢复至室温，用蒸馏水或去离子水20倍稀释。

4.1.4 稀释液

    直接使用，使用前恢复至室温，主要用于稀释酶标结合物。

4.1.5 结合物

用稀释液50倍稀释，现用现配，适量配制。

4.1.5 TMB

直接使用，使用前恢复至室温。

4.1.6 终止液

直接使用，使用前恢复至室温。

4.2注意事项

4.2.1 实验前除结合物外，其它试剂与试验样品必须恢复至室温。

4.2.2 试剂盒所有试剂需2-8℃保存，用完后应立即放回2-8℃保存。

4.2.3 用无菌蒸馏水或去离子水充分溶解冻干物质，溶解后平衡至少15分钟，

使用前混匀。

4.2.4 待检上清应先加到稀释板，然后用8道或12道的移液器转到ELISA板上，保证加入的上清孵育时间一致。

4.2.5 阴性和阳性γ-干扰素对照品和空白对照每次应加入到固定孔中，在第H行的10，11和12孔。

4.2.6 每个板条应做好标记，并适当固定板条，以防板条从板框中脱落，或防止脱落后板条顺序混乱不清，对检测造成不必要的麻烦。

4.2.7 未用完的板条应放入含干燥剂的自封袋中2-8℃保存。如果保存得当可保存至有效期止。不可混用不同批次试剂盒的板条。

4.3 操作步骤

4.3.1 试验前将所有试剂（除结合物）恢复至21°C +/- 3°C。

4.3.2 溶解冻干试剂，并平衡15 分钟。

4.3.3 每孔加入100μL 待检样品（不需稀释）和对照品（阳性、阴性和空白对照各一孔，阴性对照加入到H10孔，阳性对照加入到H11孔，空白对照H12孔）至相应孔中。在微量振荡器上振荡1min，彻底混匀。

4.3.4 封板，室温（21±3℃）孵育1 小时。

4.3.5 洗涤4 次。洗液按配制方法制备，洗涤方法如下：迅速翻转ELISA 板以倒空其内液体，避免孔与孔之间的液体混合，每孔中添加300 μl 的洗液，轻摇微

孔板，避免造成不同孔间的污染，迅速翻转ELISA 板以倒空其内液体，重复操作3 次。第4 次洗涤完毕后，将酶标板放在干净的滤纸上拍打几次，尽量除去残留的洗液。

4.3.6 每孔加入100μL 新鲜配制的酶标结合物，充分振荡混匀。按表1 稀释液稀释酶标结合物。

4.3.7 封板，室温（21±3℃）孵育1 小时。

4.3.8 洗涤4 次。洗涤方法同4.3.5。

4.3.9 每孔加入100μL 底物溶液（TMB），充分振荡混合。

4.3.10 封板，21±3℃避光孵育10min。注释：可根据颜色反应的强度延长或缩短孵育时间。

4.3.11 每孔加入50μL 终止液，轻轻摇动混匀。

4.3.12 终止后5min 内读取OD450nm 的值。

5. 结果

   结果包括分析试验的有效性和试验结果的分析。

试验的有效性

5.1 阳性对照OD值>0.700 ，否则试验视为失败，需重新检测。

5.2 阴性对照OD 值<0.150 ，否则试验视为失败，需重新检测。

结果的解释

当进行重复孔时,OD 值的计算需取平均值。

5.3 阳性＝牛PPD－PBS≥0.1（OD值） 且牛PPD －禽PPD≥0.1（OD值）。

5.4 阴性＝牛PPD－PBS<0.1（OD值） 或 牛PPD－禽PPD<0.1（OD值）。

5.5 任何的试验偏差，不正常的组份（如加入TMB后出现沉淀），操作规程中描述的出错等都应及时反馈给主管经理并出具书面报告。任何的偏差均可能会造成结果错误和不可信，因此应及时反馈通知，协商解决。

6. 参考文献

[1] Wood PR, Rothel JS, McWaters PGD, Jones SL. Production and characterisation of monoclonal antibodies specific for bovine gamma interferon. Vet Immunol Immunopath, 25:37-46(1990).

[2] Wood PR, Corner LA, Plackett P. Development of a simple, rapid in vitro cellular assay for bovine tuberculosis based on the production of IFN-γ:Res Vet Sci,49:46:49(1990).

[3] Wood PR, Corner LA, Rothel JS, Baldock C, Jones SL, Coisins DB, McCormick BS, Francis BR, Creeper J, Tweddle NE. Field comparison of the interferon-gamma assay and the intradermal tuberculin test for the diagnosis of bovine tuberculosis. Aust Vet J, 68:286-290(1991).

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