第七章 HIV-1的分离培养-全国艾滋病检测技术规范（2009年修订版

 全国艾滋病检测技术规范（2009年修订版）
第一章 样品的采集和处理-全国艾滋病检测技术规范（2009年修订版） 
第二章 HIV抗体检测-全国艾滋病检测技术规范（2009年修订版）      
第三章 HIV-1抗原检测-全国艾滋病检测技术规范（2009年修订版）      
第四章 HIV核酸检测-全国艾滋病检测技术规范（2009年修订版      
第五章 HIV-1耐药检测-全国艾滋病检测技术规范（2009年修订版      
第六章 CD4+和CD8+T淋巴细胞检测-全国艾滋病检测技术规范（2009年修订版      
第七章 HIV-1的分离培养-全国艾滋病检测技术规范（2009年修订版        
第八章 实验室生物安全-全国艾滋病检测技术规范（2009年修订版          
第九章 艾滋病检测实验室质量管理-全国艾滋病检测技术规范（2009年修订版        
附表-全国艾滋病检测技术规范（2009年修订版    

第七章 HIV-1的分离培养

1 范围

本章规定了HIV－1体外分离培养的方法和用途。 适用于对人血液和其他样本中HIV的分离培养。

2        规范性引用文件

NIAID，Virology Manual for HIV Laboratory, NIH Publication, No.97-3828.Jan 1997

3 HIV-1分离的意义

3.1 HIV抗体不确定或HIV-1阳性母亲所生婴儿的鉴别诊断。

3.2 HIV表型耐药检测及其他HIV生物学特征的研究。

3.3 HIV 感染的辅助诊断HIV-1感染窗口期。

4 实验室要求

4.1 实验室：经过认可的生物安全3级实验室。

4.2 设备：生物安全柜、二氧化碳培养箱、倒置显微镜、离心机（配水平转头）、压力蒸汽灭菌器、液氮罐、-80℃冰箱、酶标仪等。

4.3 材料：HIV阴性者抗凝全血、淋巴细胞分离液、细胞培养液（RPMI1640）、胎牛血清、白细胞介素-2（IL-2）、植物血凝素（PHA）、HIV-1P24抗原检测试剂或逆转录酶检测试剂。细胞培养瓶、细胞培养板、吸管等。

5 HIV-1分离的方法及程序

一般采用靶细胞（HIV阴性者外周血淋巴细胞，PBMC）与受检者标本（PBMC、全血、血浆、精液及其他体液）共培养的方法，最常用的方法是PBMC共培养。

5.1 样本：首选新鲜抗凝全血，也可以使用血浆、精液及其他体液。

5.2 靶细胞制备：取HIV阴性者的抗凝全血，采用密度梯度离心的方法分离PBMC，并在含有适量天然白介素-2（IL-2）和植物血凝素（PHA-P）的培养基中培养3天，使淋巴细胞由静止状态充分活化。

5.3 建立共培养：将靶细胞与待检样本混合，在合适的条件下培养，培养过程中适时换液或补加新鲜靶细胞，维持培养28天。

5.4 监测病毒生长：定时取适量培养上清液，检测HIV-1P24抗原或逆转录酶活性。也可定期观察细胞的形态，看有无HIV特征性的合胞体或其他细胞病变。

5.5 病毒鉴定：取培养上清液提取纯化RNA，或取共培养的PBMC提取纯化基因组DNA，用PCR方法扩增HIV-1特征性基因片段，对扩增阳性的片段进行基因序列测定。

5.6 判定结果和解释

5.6.1 培养上清液P24抗原或逆转录酶连续2次呈阳性反应、并有P24抗原含量/逆转录酶活性升高，或同时出现HIV特征性细胞病变，并经鉴定为HIV 基因序列，判为HIV-1分离阳性。

5.6.2 培养上清液P24抗原或逆转录酶始终为阴性，判为HIV-1分离阴性。

5.6.3 HIV-1分离培养阳性可以确证为HIV-1感染，分离培养阴性不能排除HIV-1感染。

6 质量保证和质量控制

6.1 技术人员应接受HIV分离培养技术操作和生物安全3级实验室使用的专门培训，掌握基本的细胞培养技术。

6.2 必须在生物安全3级实验室的生物安全柜内操作，使用塑料的细胞培养瓶和吸管，遵守生物安全操作规程。

6.3 受检者样本必须无菌，培养过程中注意无菌操作。

6.4 制备靶细胞时使用多人PBMC混合、去除受检者PBMC中的CD8+T细胞有助于提高分离成功率。

6.5 可同时接种一株已经分离成功的HIV-1原代毒株，以证明实验方法的可靠性。