5-O-甲基维斯阿米醇苷的含量测定高效液相色谱

5-O-甲基维斯阿米醇苷的含量测定高效液相色谱 

目的 测定感冒清热颗粒中5-0-甲基维斯阿米醇苷的含量。

方法 采用高效液相色谱法,

实验仪器：

STI501高效液相色谱仪

UV501紫外检测器

P501高压恒流输液泵

VertexC18液相色谱柱(4.6 mm×250 mm,5 μm)

条件：甲醇-水(40∶60)为流动相；流速1.0 mL/min；检测波长：254 nm。

结果 5-0-甲基维斯阿米醇苷在0.092 2～0.922 μg范围呈良好的线性关系(r＝0.999 9),平均回收率为97.9%,RSD＝0.71%(n＝6)。结论 本测定方法简便、准确、重复性好,可用于感冒清热颗粒质量控制。

【关键词】 感冒清热颗粒；5-0-甲基维斯阿米醇苷；高效液相色谱法；含量测定

    Abstract：Objective To establish a method for determining the content of 4’-O-β-D-glucosyl-5-O- methylvisamminol in Ganmao Qingre Granule by HPLC. Method The seperation was performed in Hypersil C18 colunm (4.6 mm×250 mm, 5 μm) with the mobile phase of methanol-water (44∶56). The flow rate was 1.0 mL/min and the wavelength was set at 292 nm. Results The calibration curves was linear in the range of 4.608～46.08 μg/mL for 4’-O-β-D-glucosyl-5-O-methylvisamminol (r＝0.999 9). The average recovery was 97.9%, RSD＝0.71% (n＝6). Conclusion The method is simple, reproducible and can be used for the quality control of Ganmao Qingre Granule.
　　Key words：Ganmao Qingre Granule；4’-O-β-D-glucosyl-5-O-methylvisamminol；HPLC；content determination
原标准有测定葛根中葛根素含量的方法[1]。为提升感冒清热颗粒的质量控制标准,保证临床疗效的稳定,本试验建立以高效液相色谱法测定其中主药防风的有效成分5-0-甲基维斯阿米醇苷含量的方法。

　　1  仪器与试药

   海普科技LC-10T vp高效液相色谱仪,SPD-10T型紫外检测器,VI2010色谱工作站,超声清洗仪。感冒清热颗粒(批号20060602、20060606、20060617、20060622、20060809、20060813)及阴性样品,由广西某药业有限公司提供；5-O-甲基维斯阿米醇苷对照品由中国药品生物制品检定所提供(批号1523-200203)。甲醇为色谱纯,水为超纯水,其他试剂均为分析纯。

　　2  方法与结果

　　2.1  测定波长的选择

    5-O-甲基维斯阿米醇苷对照品溶液经紫外分光光度计扫描,在254 nm处有最大吸收峰,故选择254 nm为测定波长。

　　2.2  色谱条件

    色谱柱：十八烷基硅烷键合硅胶柱Vertex C18 ,4.6 mm×250 mm,5 μm；流动相：甲醇-水(40∶560；检测波长为254 nm；流速：1.0 mL/min；柱温：室温。

系统适用性试验

分别吸取5-O-甲基维斯阿米醇苷对照品溶液、阴性样品溶液和供试品溶液各20 μL,注入液相色谱仪,得色谱图(见图1)。试验结果表明,供试品和对照品溶液有一保留时间相同的色谱峰,并且阴性样品在5-O-甲基维斯阿米醇苷峰附近无干扰,5-O-甲基维斯阿米醇苷与其它组分达到基线分离。分析时间适宜,理论板数定为不低于5 000。

　　2.4  对照品溶液的制备

    精密称取5-O-甲基维斯阿米醇苷对照品适量,置棕色容量瓶中,加50%甲醇制成每1 mL含20 μg的溶液,即得。

　　2.5  供试品溶液的制备

取装量差异项下的本品内容物,研细,取约4 g,精密称定,加甲醇50 mL,超声处理(功率250 W,频率33 kHz)1 h,放冷。称定重量,用甲醇补足减失的重量。精密吸取25 mL续滤液,蒸干,残渣加水20 mL分次充分溶解,转移至分液漏斗中,用水饱和的正丁醇提取3次,每次20 mL。合并正丁醇液,用正丁醇饱和的氨试液洗涤3次,每次10 mL。

分取正丁醇液,置水浴上蒸干,残渣用50%甲醇分次溶解,转移到10 mL量瓶中,加50%甲醇至刻度,摇匀,滤过,即得。

　　2.6  阴性样品溶液的制备

    取阴性样品,照“2.5”项下方法制备,即得。

　　2.7  线性关系考察

    精密称取5-O-甲基维斯阿米醇苷11.52 mg,置50 mL容量瓶中,加甲醇至刻度(0.230 4 mg/mL),摇匀,作为对照品储备液。精密吸取对照品储备液1.00、3.00、5.00、7.00、10.00 mL于50 mL容量瓶中,以50%甲醇稀释至刻度,摇匀过滤,分别精密吸取20 μL,注入液相色谱仪,测定。以峰面积对浓度(μg/mL)进行线性回归分析,得回归方程：A＝4.487 8×104C＋4.566 5×103,r＝0.999 9,表明5-O-甲基维斯阿米醇苷在0.092 2～0.922 μg范围内线性关系良好。

　　2.8  精密度试验

    精密吸取“2.7”项下对照品溶液20 μL,连续进样6次,测定,RSD＝0.15%(n＝6),表明精密度较好。

　　2.9  稳定性试验

    取同一供试品溶液(批号20060617),分别在放置0、2、4、6、8、12 h后,依法测定1次,结果显示,12 h内供试品溶液中5-O-甲基维斯阿米醇苷峰面积稳定,RSD＝0.17%,表明稳定性较好。

　　2.10  重复性试验

    取同一批样品(批号20060617)6袋,研细,精密称定6份,按供试品溶液制备方法制备6份供试品溶液,依法测定,5-O-甲基维斯阿米醇苷平均含量为1.025 mg/袋,RSD＝0.42%(n＝6),表明重复性较好。

　　2.11  加样回收率试验

    精密称取已知含量的样品(批号20060617,含量为1.025 mg/袋,0.084 mg/g)6份,分别精密加入一定量的5-O-甲基维斯阿米醇苷对照品,依法测定,计算回收率,结果见表1。表1  加样回收率试验结果(略)
 
　　2.12  样品测定

    取不同批次的样品,按照供试品溶液制备项下方法操作,得供试品溶液,按上述色谱条件分析测定,结果见表2。表2  5-0-甲基维斯阿米醇苷含量测定结果（略）

    根据6批测定结果,我们将含量限度确定为本品每袋含防风以5-O-甲基维斯阿米醇苷(C22H28O10)计算不得少于0.60 mg。

　　3  讨论

    由于本品是含糖型颗粒,应在样品溶液的处理过程中考虑去糖。笔者曾试验在样品超声提取后,精密吸取25 mL提取液,浓缩至5 mL加至D101型大孔吸附树脂柱上进行去糖处理。结果显示,对样品去糖与不去糖处理,两者色谱图无明显差别,且不去糖样品5-0-甲基维斯阿米醇苷无损

失,5-0-甲基维斯阿米醇苷的含量较高。
   
　　我们考察了甲醇-水、乙腈-磷酸水、乙腈-水系统,结果以甲醇-水(44∶56)为流动相时,5-0-甲基维斯阿米醇苷的分离度和峰形最好。供试品制备方法考察时,笔者曾试验以水饱和的正丁醇提取5次,结果表明,提取3次时已基本将5-0-甲基维斯阿米醇苷提取完全,故将提取次数定为3次。

【参考文献】
  　[1] 国家药典委员会.中华人民共和国药典(一部)[S].北京：化学工业出版社,2005.644.

【作者单位】：杭州海普科技有限公司;浙江大学研究所;浙江大学医学院

公司网站：www.htcoo.com

制作者：林东下，浙江大学研究所，，

关键词：5-0-甲基维斯阿米醇苷，高效液相色谱法，5-0-甲基维斯阿米醇苷检测方法