反相高效液相色谱法测定地榆中金丝桃苷的含量

【摘要】目的建立地榆中金丝桃苷的高效液相色谱含量测定方法。方法采用RP-HPLC测定，C18柱，流动相为甲醇-0.2%磷酸溶液（46∶54），用三乙胺调pH至3.0，流速1.0 ml·min-1，检测波长370 nm；供试品溶液的制备采用甲醇超声提取。结果测定了不同产地不同批次的地榆药材，金丝桃苷质量分数在0.052%～0.291%。结论该方法灵敏快速，准确可靠，可用于地榆的质量控制。

　　【关键词】  地榆 金丝桃苷 反相高效液相色谱法

　　Abstract:ObjectiveTo establish a determination method of hyperoside in Sanguisorba officinalis. MethodsRP-HPLC analytical method was established on a Polaris C18column with Methanol-0.2%H3PO4 solution(46:54) as the mobile phase, the flow rate was 1.0 ml·min-1, and the detection wavelength was 370 nm. The method of sample was ultrasonic wave withdraws by Methanol. ResultsThe content of hyperoside was from 0.052～0.291% in different groups of S. officinalis collected from the different locations. ConclusionThe method is  accurate and can be used for the quality of Sanguisorba officinalis.

　　Key words:Sanguisorba officinalis;   Hyperoside ;  RP-HPLC

　　地榆为蔷薇科植物地榆Sanguisorba officinalis L.或长叶地榆Sanguisorba officinalis L.var.longifolia（Bert.）Yu et Li 的干燥根。其味苦、酸、涩，微寒，具有凉血止血、解毒敛疮之功效［1，2］。现代药理研究表明其具有显著的镇痛作用［3］，主要有效成分为黄酮类化合物，但药典记载质量标准的定量检测方法仅为紫外-可见分光光度法测定其鞣质含量，该法操作繁琐。金丝桃苷为地榆药材中提取得到的黄酮类化合物。研究表明，地榆中的金丝桃苷是其止痛作用的有效成分之一。本实验采用RP-HPLC法对不同产地中药材市场商品地榆的金丝桃苷成分进行了定量分析，考察了流通商品地榆的质量状况，为进一步提高地榆药材的质量控制提供了科学依据。

　　1  仪器与试药

　　Agilent 1100高效液相色谱仪，含在线脱气机、四元梯度泵、自动进样器、智能柱温箱、紫外可见光检测器（VWD）、化学工作站。KQ5200B型超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司)。

　　地榆药材于200607中下旬从青海省各地中药材市场抽取，由青海省药品检验所主任药师刘海青鉴定为地榆S. officinalis L.的干燥根或饮片。实验中将样品粉碎后过100目筛，置干燥器中备用。

　　金丝桃苷（111521-200303，国药品生物制品检定所,供含量测定用）。甲醇为色谱纯，实验用水为Milli-Q超纯水。其他试剂均为分析纯。

　　2  方法与结果

　　2.1  对照品溶液的制备

　　精密称取金丝桃苷13.25 mg，置量瓶中，加甲醇定容至25 ml，其金丝桃苷含量为0.53 mg·ml-1。再精密吸取金丝桃苷对照品溶液2.0 ml，加甲醇定容至50 ml量瓶中，其金丝桃苷含量为0.021 2 mg·ml-1。

　　2.2  供试品溶液的制备

　　取地榆干燥药材或饮片的粉末（过100目）1 g，分别精密称定，至具塞锥形瓶中，精密加入甲醇100 ml，称定重量，超声提取1 h，放冷，再称定重量，用甲醇补足减失的重量，摇匀，用0.45μm微孔滤膜滤过，用续滤液作为供试品溶液。

　　2.3  色谱条件

　　Hypersil ODS2分析柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流动相甲醇-0.2%磷酸溶液（46：54），用三乙胺调pH至3.0；流速1.0 ml·min-1；检测波长370 nm；柱温25℃；进样量10 μl；在选定的色谱条件下，色谱柱的分离效率（简称柱效）>理论塔板数以金丝桃苷峰计算不低于3 000。分离度大于1.5，拖尾因子在0.95～1.05。色谱图见图1。

　　2.4  检测波长的选择

　　取金丝桃苷对照品适量，用甲醇溶解后作紫外全波长扫描，λ286，370 nm, 因286 nm下非黄酮物质也有吸收，为避免干扰，选择检测波长为370 nm。

　　2.5  线性关系的考察

　　分别精密吸取0.021 2 mg·ml-1的金丝桃苷对照品溶液2，4，6，8，10，12，16 μl注入液相色谱仪，测定基线构成之面积称峰面积。A＝×σ×h＝2.507σh＝1.064 Wh/2h>峰面积，以金丝桃苷含量（X）为横坐标，其峰面积吸收度积分值（Y）为纵坐标，绘制标准曲线，其回归方程为：Y = 2 263.9X+2.963 5，r = 0.999  8（n =7），表明金丝桃苷在0.04～0.34 μg线性关系良好。
　　2.6  精密度实验

　　精密吸取0.021 2 mg·ml-1金丝桃苷对照品溶液10 μl，连续进样5次，测得峰面积积分值RSD为0.86%，表明精密度良好。

　　2.7  重复性实验

　　精密称取同一样品粉末1 g（5份），按供试品溶液的制备方法制备，进样10 μl，测得金丝桃苷含量的RSD为0.99%，表明该方法的重复性好。

　　2.8  稳定性实验同一供试品溶液，从制备完毕开始放置，分别于0，2，4，6，8，10 h进样检测，其峰面积积分值RSD为1.9%。表明供试品溶液在10 h内比较稳定。

　　2.9  加样回收率实验

　　取已知含量的药材（6号含量1.60 mg·g-1）样品6份，每份0.50 g，精密称定，计算样品中金丝桃苷量，分别加入适量的金丝桃苷对照品，按样品制备方法和测试条件进行测定，计算加样回收率。结果见表1。表1  地榆中金丝桃苷的加样回收率（略）

　　2.10   样品测定

　　分别精密吸取各样品10 μl进样测定，计算含量，结果见表2。 表2  不同产地地榆样品的金丝桃苷含量（略）

　　3  讨论

　　3.1  提取条件的选择

　　根据金丝桃苷的溶解性能，选择乙醇、甲醇、醋酸乙酯作为提取溶剂，比较了3种提取溶剂提取方法（超声、回流及索氏提取）和不同提取时间（0.5，1.0，1.5 h）对提取效果的影响。结果显示采用超声提取方法的提取率最高，甲醇提取效果最好，含量结果表明超声提取1.0 h可使待测成分提取完全。实验证实，含量并未随着提取时间延长而有所增加，超过1 h时含量甚至有下降的趋势。

　　3.2   流动相的选择

　　由于金丝桃苷为黄酮类化合物，本实验采用甲醇和0.2%磷酸溶液的二元流动相体系，但实验中发现拖尾峰(tailing peak)。前者少见。>色谱峰有拖尾现象。经反复实验发现，在1 000 ml的0.2%磷酸溶液中加入1.8 ml三乙胺时的分离效果最佳，经多次，多批样品测试，系统具有良好的重复性和稳定性，三乙胺能与ODS柱中键合相的残余硅醇基相互作用，提高分离度，有助于改善峰形。因此以甲醇-0.2%磷酸溶液（46∶54）用三乙胺调pH至3.0为优，分离效果较好，保留时间适中，且无干扰［3］。本方法操作简便、快速、重复性好，适用于地榆中金丝桃苷含量的测定。

　　3.3  样品分析

　　本文对不同产地地榆中的金丝桃苷含量进行了测定，结果表明，不同产地金丝桃苷的含量存在着一定的差异，有必要对其进行质量控制。

　　《中国药典》中地榆质量标准的定量检测方法操作较为繁琐，根据本实验的测定结果，RP-HPLC可以较好地对金丝桃苷进行有效分离，方法简便、准确、灵敏，可作为地榆质量控制的指标成分。

　　【参考文献】
　　［1］国家药典委员会.中国药典，Ⅰ部［S］.北京：化学工业出版社，2005：83.

　　［2］江苏新医学院. 中药大辞典，上册［M］.上海：上海科学技术出版社，1981：806.

　　［3］沙 明，曹爱民，孟宪生，等.高效液相色谱法在中药规范化研究中的应用［M］.沈阳：辽宁科学技术出版社，2000：24.

本篇文章来源于 反相高效液相色谱法测定地榆中金丝桃苷的含量|科学仪器在线 原文链接：http://www.hg17.com/knowledgeview3623.html