高效液相色谱法测定天山花楸中的绿原酸含量

【摘要】 　　目的建立ＨＰＬＣ 梯度洗脱法测定天山花楸叶与果中绿原酸含量的方法。方法采用ＺＯＲＢＡＳ ＯＤＳ Ｃ１８ （４．６ ｍｍ ×１５ ｃｍ，５ μｍ）色谱柱，甲醇－０．０２％磷酸溶液为流动相（梯度洗脱），流速为１．０ ｍｌ· ｍｉｎ－１，检测波长为３２６ ｎｍ。结果绿原酸线性范围为３．９５２ ～１９．７６ μｇ／ｍｌ，叶中绿原酸含量１．９８２％ （RSD＝０．５８％，n＝３），平均回收率为９９．４２％；果中绿原酸含量２．２５９％ （RSD＝１．２％，n＝３），平均回收率为９９．３２。结论 该方法经济、简便、快速、准确、可靠，可用于该药材的质量控制。

　　【关键词】  天山花楸 绿原酸 高效液相色谱法 梯度洗脱

　　Abstract：ObjectiveＴo establish ｍｅｔｈｏｄｓ ｆor ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ ｏｆ ｃｈｌｏｒｏｇｅｎｉｃ ａｃｉｄ ｉｎ Sorbus tianschanica．MethodsＴｈｅ ＨＰＬＣ ｓｙｓｔｅｍ ｃｏｎｓｉｓｔｅｄ ｏｆ ｔｈｅ ｃｏｌｕｍｎ ｏｆ ＯＤＳ ＺＯＲＢＡＳ ＯＤＳ （４．６ ｍｍ ×１５ ｃｍ，５ μｍ） ｃｏｌｕｍｎ ａｎｄ ＭｅＯＨ －０．０２％Ｈ３ ＰＯ３ ａｓ ｔｈｅ ｍｏｂｉｌｅ ｐｈａｓｅ．Ｔｈｅ ｆｌｏｗ ｒａｔｅ ｗａｓ １．０ ｍｌ· ｍｉｎ－１ ．Ｔｈｅ ｄｅｔｅｃｔｉon ｗａｖｅｌｅｎｇｔｈ ｗａｓ ３２６ ｎｍ．ResultsＴｈｅ ｍｅｔｈｏｄ ｗａｓ ｌｉｎｅａｒ ｗｉｔｈｉｎ ｔｈｅ ｒａｎｇｅ ｏｆ ３．９５２ ～１９．７６ μｇ／ｍｌ．Ｃｈｌｏｒｏｇｅｎｉｃ ａｃｉｄ ｉｎ ｔｈｅ ｌｅａｆ ｏｆ S．tianschanica ｗａｓ １．９８２％（RSD％ ＝０．５８，n＝３）ａｎｄ ｔｈｅ ａｖｅｒａｇｅ ｒｅｃｏｖｅｒｙ ｗａｓ ９９．４２％. Ｃｈｌｏｒｏｇｅｎｉｃ ａｃｉｄ ｉｎ ｔｈｅ ｆｒｕｉｔ ｏｆ S．tianschanica ｗａｓ ２．２５９％（RSD％ ＝１．２，n＝３） ａｎｄ ｔｈｅ ａｖｅｒａｇｅ ｒｅｃｏｖｅｒｙ ｗａｓ ９９．３２％．ConclusionＴｈｅ ｍｅｔｈｏｄ ｉｓ ｓｉｍｐｌｅ， ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ， ｑｕｉｃｋ ａｎｄ ｈｉｇｈｌｙ ｒｅｐｒｏｄｕｃｔｉｖｅ ａｎｄ ｉｔ ｉｓ ｓｕｉｔａｂｌｅ ｆｏｒ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｃｈｌｏｒｏｇｅｎｉｃ ａｃｉｄ ｉｎ Ｓ．ｔｉａｎｓｃｈａｎｉｃａ．

　　Key words：Sorbus tianchanica；  Ｃｈｌｏｒｏｇｅｎｉｃ ａｃｉｄ；  ＨＰＬＣ；  Ｇｒａｄｉｅｎｔ ｅｌｕｔｉｏｎ

　　蔷薇科Rosaceae 花楸属植物天山花楸Sorbus tianschanica，为维吾尔和哈萨克族民间常用药材。药理实验显示［１ ～３］ ，天山花楸枝叶兼有止咳、平喘、强心等多种药理功效，并且毒性很低。绿原酸是天山花楸中有效成分之一，广泛存在于自然界，属于咖啡酰奎尼酸衍生物，是植物体内有氧呼吸过程中经莽草酸途径产生的一种苯丙素类化合物，为众多药材抗菌解毒、消炎利胆的主要有效成分。绿原酸除了抗氧化能力强外，还具有抗艾滋病毒、抗过敏、抗肿瘤等功能［４ ～７］ 。由于天山花楸中的绿原酸定量研究尚未见报道，为了了解天山花楸中绿原酸的含量，更全面、综合地评价这一药用植物，更好地控制药材质量，开发传统中药材的潜力，我们建立了测定天山花楸叶与果中绿原酸的高效液相色谱方法［８，９］ 。

　　1  仪器与试药

　　Ａｇｉｌｅｎｔ ＨＰ１１００ 型高效液相色谱系统，配有：四元泵，紫外检测器，ＨＰ１１００ 化学工作站；日本岛津ＵＶ ２４０１（ＰＣ）紫外光谱仪；德国Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ ＢＰ２１１Ｄ 十万分之一电子分析天平；索氏抽提装置；甲醇为色谱纯，水为二次重蒸水，其他试剂均为分析纯；天山花楸供试品自制；绿原酸对照品由中国药品生物检定所提供。

　　2  方法与结果

　　2.1  色谱条件色谱柱为ＺＯＲＢＡＳ ＯＤＳ Ｃ１８ （４．６ ｍｍ ×１５ ｃｍ，５μｍ）色谱柱，检测波长为３２６ ｎｍ；柱温３５℃；流速１．０ ｍｌ·ｍｉｎ－１ ；进样量２０ μｌ。流动相洗脱梯度见表１。

　　表1  流动相梯度洗脱（略）

　　2.2  对照品溶液和供试品溶液制备

　　2.2.1  绿原酸对照品溶液称取绿原酸对照品约２０ ｍｇ，精密称定，置１００ ｍｌ 棕色容量瓶中，甲醇溶液稀释至刻度，作为贮备液。精密吸取贮备液５ ｍｌ，置２５ ｍｌ 棕色容量瓶中，加甲醇溶液至刻度，摇匀，即得对照品溶液。

　　2.2.2  天山花楸叶供试品取６０ ℃常压干燥至恒重天山花楸叶粉末约０．５ ｇ，各３ 份，置索氏提取器中，加乙醚约８０ ｍｌ，加热回流至无色，弃去乙醚，药渣挥干，再加甲醇８０ ｍｌ，加热回流提取至无色，转移至１００ ｍｌ 容量瓶中，甲醇定容，即得待测天山花楸叶供试品溶液。

　　2.2.3  天山花楸果供试品取３ 份６０ ℃常压干燥至恒重的天山花楸果实粉末约０．５ ｇ，置索氏提取器中加甲醇８０ ｍｌ，加热回流提取至无色，移至１００ ｍｌ 容量瓶中，甲醇定容，即得待测天山花楸果供试品溶液。

　　2.3  线性关系考察及稳定性实验精密移取１．０，２．０，３．０，４．０，５．０  ｍｌ 绿原酸对照品溶液，分别置１０ ｍｌ 棕色容量瓶中，用０．４５ μｍ 滤膜过滤，收集续滤液，进样量２０ μｌ，按上述色谱条件测定。以基线构成之面积称峰面积。A＝×σ×h＝2.507σh＝1.064 Wh/2h>峰面积Ａ 对对照品浓度（μｇ／ｍｌ）进行线性回归，得标准曲线回归方程：A＝４６．１０７C－５９．５３２，r＝０．９９９ ６。绿原酸线性范围为３．９５２ ～１９．７６ μｇ／ｍｌ。取上述对照品溶液，每隔２ ｈ 按上述色谱条件测定峰面积，结果表明在１２ ｈ 内基本稳定（RSD＝２．８％）。

　　2.4  精密度实验精密移取对照品液２．０ ｍｌ，置１０ ｍｌ 棕色容量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，照“２．３”项下进样，连续进样５ 次，绿原酸含量RSD＝２．７％。

　　2.5  重复性实验精密量取已知绿原酸含量的叶与果供试品溶液０．８ ｍｌ，移至１０ ｍｌ 棕色容量瓶中，甲醇定容，照“２．３”项下进样，连续进样５ 次，叶的绿原酸含量RSD＝２．８％；果的绿原酸含量RSD＝０．７４％。

　　2.6  回收率实验精密移取已知绿原酸含量的样品０．８ｍｌ，置１０ ｍｌ 棕色容量瓶中，精密加入定量低、中、高浓度的对照品液，加甲醇稀释至刻度，照“２．３”项下操作测定。叶：平均回收率＝９９．４２％，RSD＝２．１％（n＝９）；果：平均回收率＝９９．３２％，RSD＝２．４％（n＝９）。

　　2.7  样品测定精密量取供试品溶液０．８ ｍｌ，移至１０ ｍｌ 棕色容量瓶中，甲醇定容，照“２．３”项下进样，代入标准曲线，即得。结果：天山花楸叶中绿原酸的平均含量为１．９８２％， RSD ＝０．５８％（n＝３）；天山花楸果中绿原酸的平均含量为２．２５９％，RSD＝１．２％（n＝３）。见图１。

　　图１  绿原酸ＨＰＬＣ 色谱图（略）

　　3  讨论

　　对照品绿原酸对其进行紫外扫描，绿原酸在３２６ ｎｍ 有较强吸收，因此选择３２６ ｎｍ 为测定波长。

　　曾选择甲醇－０．０２％磷酸溶液（１０∶９０）的等度洗脱色谱条件，但绿原酸保留时间过长，ｔＲ 为１４ ｍｉｎ， 一次检测完成约需３０ｍｉｎ。经摸索后采用梯度洗脱，使待测组分绿原酸以较短时间ｔＲ为４．４ ｍｉｎ 出峰，随后使洗脱梯度变大，流动相的极性也变大，极性弱的组分快流出柱。

　　【参考文献】

　　［1］ 李迪民．天山花楸水提液药理学研究［ Ｊ］．中草药，１９９５，２６（６）：３０２．

　　［2］ 李迪民，陈 坚．天山花楸醇提取物药理作用的研究［Ｊ］．西北药学杂志，１９９９，１４ （１）：１４．

　　［3］ 于 明，李 铣．花楸属植物化学成分药理作用及其研究进展［Ｊ］．辽宁中医学院学报，２００４，６（５）：３６４．

　　［4］ 高锦明，张鞍灵，张康健，等．绿原酸分布、提取与生物活性研究综述［Ｊ］．西北林业学院学报，１９９９，１４（２）：７３．

　　［5］ 张鞍灵，马 群，高锦明，等．绿原酸及其类似物与生物活性［Ｊ］．中草药，２００１，３２（２）：１７３．

　　［6］ 胡克杰，孙考祥，王憬璐，等．绿原酸体外抗病毒作用研究［Ｊ］．哈尔滨医科大学学报，２００１，３５（６）：４３０．

　　［7］ 尉 芹，马希汉．绿原酸及其提取分离方法评述［Ｊ］．中成药，２００１，２３（２）：１３５．

　　［8］ 解成喜，张丽静，范维刚．反相高效液相色谱法测定罗布麻叶中绿原酸的含量［Ｊ］．分析实验室，２００６，２５（２）：１６．

　　［9］ 李建中，马 良，崔 同，等．山楂果实中主要活性物质的高效液相色谱分析［Ｊ］．色谱，２００５，２３（１）：１１．

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