实时定量PCR关键技术

实时定量PCR技术在科学应用上被誉为一门艺术。实时荧光定量PCR技术一直没有真正的实验标准，不同实验平台上得到的结果之间可能完全没有可比性。前段时间生物通推出的生物技术专题“定量PCR技术报告”系列文章受到了读者的关注。在此基础上，生物通收集编译世界各地多位Real-time PCR专家们在多年实验的经验之谈，就实时定量PCR技术中5大关键问题畅谈个人心得，希望能对您的实验有所帮助。记住，本文并不打算告诉你什么是最好的或者是正确的观点，即使专家们的看法也各有不同，本文仅仅是提供多位定量PCR老手的看法供你参考借鉴，从中取其精华结合自己的观点才是真正重要的。

Q1: What are your criteria for high-quality RNA?
Q2: What pre-amplification methods have you applied and validated?
Q3: How do you measure intra- and inter-assay variation?
Q4: What do you consider when selecting your quantification strategy?
Q5: What standards and templates do you use?

一、real time RT-qPCR技术要点之一：什么是高质量RNA标准？

    real time RT-qPCR 是检测样本中特定基因表达量的有效方法，包含逆转录步骤和定量PCR步骤。好的开始是成功的一半，获得高质量的、能正确反应样品中转录情况的RNA，对于其后的定量结果，自然是非常重要的。

Mikael Kubista，教授, R&D TATAA Biocenter主任：
    RNA质量包含两个方面：样品的纯度和RNA的完整性。样品纯度可以在样品稀释时得到改善。我们通常通过Nanodrop测量吸光值来检测纯度。260/280吸光值的比率应该在2至2.1的范围内，并且是“漂亮”的吸光光谱曲线。230nm吸收峰应该低。我们通过利用Experion (Bio-Rad)记录电泳图（electropherogram）检测RNA的质量。当然，最理想的结果是得到很清晰的18S和28S峰值。但RNA的完整性是无法改善的，保存样品、固定样品和来源于富含降解酶的器官的样品RNA完整性通常不好。检测RNA质量的两个原因，一是想要知道某一个实验得到的RNA质量，从而选择适当的RT-qPCR方法，二是识别出研究中的样品的质量是否比正常情况差，避免导致偏差或者不正确的结果。

Jo Vandesompele，根特大学医院（Ghent University Hospital）医学遗传学中心
    高质量的RNA应该是完整的、不含抑制剂的。我们习惯利用毛细管凝胶电泳系统来评价28S和 18S条带的比率，过程很快速并且只需要很少量的RNA。值得注意的是，这个比率是组织或者细胞特异的，所以理想的是你应该将样品与一个同样细胞来源的完整对照比较。在芯片分析（微阵列研究）中通常都要求进行RNA质量分析，现在许多定量PCR领域的人们开始考虑RNA质量这个因素。我们最近在发表的文章说到评价用于PCR分析的RNA的质量尤为重要，这是由于并非每个基因降解水平都相同，严重时甚至可以使你的实验结果出错(Perrez-Novo et al., 2005)。我们主要的结论是：参考基因(reference gene)的稳定性在完整样品（intact）和在降解样品中是有差别的，因此你不应该将完整的样品和降解的样品相比，尤其是你在研究精确的表达差异时。

    检测核糖体吸收峰值是目前评价RNA完整性的金标准，但其实rRNA仅是mRNA成分完整性的一个代言标记。我们开发了一种基于PCR的分析实验，可以比较一个特定基因的5'和 3' 端amplicons的比率。通过比较未知样品和完整的对照样品的比率，我们能够利用PCR分析实验衡量mRNA的完整性，与电泳评估/rRNA评估相比更具有直接相关性。

    为了评价制备RNA的纯度（例如没有抑制剂），我们实行qPCR SPUD分析，既简单易用又免费(Nolan et al., Anal Biochem, in press).

Tim Hunter，英国伦敦大学学院（UCL）：
    你需要建立灵活的操作流程来分离高质量的RNA。样品类型决定着哪一种分离方法是最好的。通常，初步的质量监控检查是在NanoDrop 分光光度计进行核酸定量的时候，260吸收峰外的读数值可指示污染情况。260/280的比率应该在1.8 至2.1的范围内。同样非常关键的，是要保证实验所用的RNA质量（全长、完整性）不打折扣，因此，我们通常利用Agilent 2100 Bioanalyzer检查RNA的完整性，并根据rRNA峰值的完整性判断RNA样本的情况，选择下一步实验适合的方法。假如有证据显示重要样品有降解，我们会同时检测一个在该样品中已知稳定的管家基因，来观察是否出现由于转录产物不完整而导致管家基因在这个样本中的表达改变。当探针并非处于外显子—外显子边界时，我们会同时选择中/高表达的管家基因作(-)RT对照，以检查基因组DNA的污染情况。样品可在37ºC下孵育2-4小时，并重新在Bioanalyze上分析降解情况，以检查核酸酶的活性。

Cristina Hartshorn,美国Brandeis大学生物学系：
    我认为高质量RNA是指正确代表细胞内容物的转录池（transcript pool）的RNA。我们实验室非常注重RNA的回收率，尤其是来源于像单个细胞等的微量样品中RNA的纯化，需要尽量减少可能导致核酸降解的操作步骤。因此，我们开发了一种能在同一支试管里连续进行收集细胞、裂解细胞、去除蛋白杂质、逆转录和实时定量PCR等操作的整体流程。这种整个实验在单个试管内进行的方法称为PurAmp (Hartshorn et al., 2005a; Hartshornet al., 2005b)，该方法基于稀释法，并且不需要将RNA结合到任何纯化基质上去，因此保证了实质上纯化得到完整的RNA库。此外，我们觉得转录产物的完全去蛋白化对于RT引物与模板的正确结合、以及最终模版定量的精确性和可重复性来说是十分必要的，这就像对基因组DNA模板制备来说是必需的一样。

    PurAmp方法有时要求一个DNase消化的步骤，但是我比较喜欢避免这一步。我尝试过多种DNase操作方法，但结果总是发现回收的RNA比预期的少。这可能是因为最后一步高温失活酶的步骤导致了RNA的水解。一些商品化的手册表明经过“+ / - DNase”处理后的实时PCR循环，特定样品的信号会出现几个循环的Ct漂移（shift）。其实，考虑到每个细胞中特定的基因的拷贝数比该基因表达时的转录产物的拷贝数少得多，这种漂移几乎是难以察觉的，因此，不应该在DNase消化后稀释模板数量。我喜欢一起扩增DNA和RNA模板，最后消减去基因组DNA的拷贝数（详细请见Question 5）。

Jim Huggett，佛蒙特州大学（University of Vermont）癌症中心：
    我们在英国的实验室通常利用Agilent Bioanalyzer评估核糖体RNA条带来评估纯化RNA的质量。然而，由于我们在撒哈拉以南的非洲国家开展许多研究工作，这里仪器缺乏，所以我们要用琼脂糖凝胶电泳来评价rRNA，从而告诉我们核糖体RNA条带是否OK，以及我们的RNA提取工作是否有效；然而，越来越多证据表明，这些rRNA条带的降解不一定意味着mRNA降解。用什么方法进行质量评估是个人的喜好，现有的评估方法还是必需的。

Xiuling Zhang,纽约州卫生署（New York State Department of Health）Wadsworth Center:
对于从人类组织中分离的RNA样品来说，我的高质量RNA标准是：
1． rRNA 比率 [28s/18s] ≥ 1. 1, RNA完整系数 (RIN)≥ 7 (利用Bioanalyzer 2100进行分析)
2. 28s和 18s 条带明显(变性琼脂糖凝胶电泳)
3. 比率 [260nm/280nm] ≥ 2.0 (分光光度计测量).

 

实时定量PCR技术要领之二：你选择哪种有效的预扩增方法？

Tim Hunter，佛蒙特州大学（University of Vermont）癌症中心：
    目前，对于低丰度目标样品或者低回收率的核酸，我们不需要使用预扩增（pre-amplification）步骤来产生足够的起始材料。我们在逆转录反应中设计的一种特殊的引物策略通常能解决目标样品的低表达问题。目前市场上已经有几种系统能很好地解决样品的低表达问题，但确证预扩增步骤不会在实验分析中产生偏差，对于实验是非常之关键的。

Mikael Kubista，Professor, R&D TATAA Biocenter主任：
    我们参与[NuGen公司的] Ovation mRNA扩增技术的多实验室验证，以及[ABI公司的] TaqMan PreAmpMaster Mix Kit（用于在qPCR前预扩增cDNA）的Beta 测试。两个产品我们用起来都不错。我们用后一种产品来研究单个细胞内多种基因的表达。所有扩增子的引物都加入样品中，浓度远低于常规PCR，进行14个循环的预扩增后停止反应，反应产物被稀释并用作第二次PCR反应的模板，第二次PCR每个反应使用单对引物和探针。一次可以平行预扩增多达100种目的基因。最直接检测预扩增效果的方法，是选择一些浓度较高的样品，同时平行地进行预扩增和直接扩增，从而比较多个基因的表达模式（比率）是否得以保留。我们同样也利用一种高表达基因，如18s作为预扩增的内参（internal control）。

 Jo Vandesompele，根特大学医院（Ghent University Hospital）医学遗传学中心：
    我们评估了几种全转录组（whole-transcriptome）扩增方法，包括基于T7 RNA聚合酶的线性RNA扩增方法和基于PCR的指数扩增方法。我们最重要的质量指标，是扩增前后样品之间的基因表达比率的一致性，倒不是基因之间的一致性。由于不同转录产物的扩增效率不同，多数扩增方法都会带入由此而引起的偏差（这种偏差通常是可重复的），这就意味着你不能简单地在预扩增后比较基因的表达水平——就算不进行预扩增，而采用直接扩增，这种比较本来也是困难的，可能有偏差的）。幸好，好的试剂盒或多或少能够保持样品之间表达率的一致性，这正是目前我们最关心的东西。除了全基因组/全转录组预扩增方法外，最近出现的其他方法，首先对一组挑选出来的基因进行循环次数有限的预扩增步骤，紧接着稀释产物并对每个目标进行单基因检测。对于已知预定目标基因的研究来说，这些方法显得更适合。

定量PCR操作要点之三：怎么衡量inter-assay和intra-assay间的差异？

    荧光实时定量PCR的所谓“定量”需要借助已知拷贝数的参照进行比较，或者比较不同目标之间的信号进行相对定量，这种比较的前提是各目标的反应条件的一致性，对于灵敏度如此之高的反应来说，两个样本之间反应条件的毫厘之差就可能影响结果。事实上，不同批次、不同反应管之间都很难做到“所有”反应条件完全一致，比如各成分的浓度，比如仪器的系统误差如96孔板加热的边缘效应、逐个孔读数（PMT）的时间积分问题或者是CCD读数的光程差距和干扰问题等等，都可能导致inter-assay（批间）和intra-assay（批内）间的差异。不同实验平台上得出的数据之间没有可比性、可重复性。如何评估这个差异呢？

Cristina Hartshorn，美Brandeis大学生物学：
　  LATE（Linear-After-The-Exponential，指数后线性扩增PCR技术是由Brandeis大学Wangh发明的一种不对称PCR新技术）PCR技术的发展为我们提供了更灵敏的新工具来监控实时定量PCR实验中的inter-assay和intra-assay的差异。LATE-PCR能高效地产生单链的扩增子（amplicons），很有优势(Sanchez et al.,2004; Pierce et al., 2005)。

    我们近期的基因表达研究采用了LATE-PCR技术。线性扩增使得我能够同时检测单个细胞的多个转录本，哪怕这些转录产物的量差别很大。在传统的对称双重PCR（duplex PCR）中，高丰度的转录本（模版数多）具有扩增优势，很快荧光信号达到了平台期，这时PCR反应物池中的成分可能在某种程度上已经大量消耗，因此可能降低了第二个转录本，或者说低丰度模板扩增的效率。相反，在实时LATE-PCR分析中，所有的扩增子线性累积，并且所有的荧光信号具有一个不变的斜率，直到反应终止，不会达到平台期。这种策略保证了不同丰度的多种mRNAs的共同扩增和可靠定量。

    我发现实时LATE-PCR过程中荧光信号连线的斜率（slopes）对监控intra-assay的差异极为灵敏，因为它们会受到反应中的很细微差别的影响而变化，而这中细微的变化在对称PCR中是无法觉察的。这对我的工作很有帮助，因为我在同一试管里通过稀释来进行细胞裂解、反转录和PCR。我觉得考查LATE-PCR和RT PCR联合使用的这些特点是非常有意义的，因为这使得最终定量基因表达成为可能。

Jim Huggett，英国伦敦大学学院（UCL）：重复实验来平衡差异

    我越来越觉得intra-assay的差异其实没什么意思，尽管这很容易检测。因为如果你的PCR方法是通用且高效的话，实际上不会带来多少的变异。

    inter-assay差异，才是真正的问题所在，尤其是RT-PCR。这不仅是由于样品的生物差异性，而且还由于cDNA合成的过程中涉及多个步骤，特别容易引入误差。因此我更愿意通过平行重复实验来平衡大部分差异，例如：理想的是从提取样品前，就每组的数量，平行重复实验。这当然需要花费更多的工作和金钱，但你的发现结果将会更有代表性。

Tim Hunter，佛蒙特州大学（University of Vermont）癌症中心：
    外参和内标通常可以用于衡量一段时间内实验的可重复性。外参可以是实验室制备的样品或者是从制造商购买来的参照。比较不同时期同一实验中标准参照的数据偏差，就评价inter-assay和intra-assay的差异。

Mikael Kubista，Professor, R&D TATAA Biocenter主任：
    inter-assay的差异可以通过所有qPCR中添加一个相同样品来评估，确保Ct的标准偏差并不比同一板上的两个重复样品的标准偏差大很多。

    intra-assay差异（批内差，孔间差）由重复样品来监控。重复样品应该尽可能在实验初期就开始设置，从而尽可能更多地反应样品间的差异。相比于逆转录反应的偏差，qPCR的技术偏差其实无关紧要（Ståhlberg et al., 2004），包括样品抽提的误差的影响也比qPCR大得多。样品采集也可能是偏差的一个重要来源，尤其当分析组织样品的时候——因为多数组织材料是包含不同类型细胞的混合样品。最佳的情况当然是利用激光显微切割来收集同源的样品材料——即使是这样也应该收集几份样品便于比较。如果采集的样品非常微小——比如激光显微切割出来的几个细胞，那么单个细胞之间的本身的表达差异将变得十分显著(Bengtsson et al., 2005).

Jo Vandesompele，根特大学医院（Ghent University Hospital）医学遗传学中心：
    对于基因表达分析来说，我们在同一板上进行复制反应，并且利用平均量化循环值和标准误差进行计算 。在进一步的计算中，我们利用delta方法来传导误差，最终在具有各自相应的误差的情况下得到正常和重新调整的相对数量，反映分析间变异。值得指出的是，不需要在同一个板上测试参考基因和目的基因。这些是独立的分析实验，并且相互之间没有任何的联系。分析内差异或者 run-to-run差异是通常被低估一类变异。许多人们相信，量化循环值是一个绝对值，并且可以在实验运行之间进行比较。然而，这个值仅仅在一种特殊的运转或者平板中有意义。为了比较不同板上得到的结果，一个板需要一种inter-run校准器（calibrators），例如在两个板（同样的阳性对照、未知样品、或者标准稀释点）上测试模板。inter-run校准器使用的越多，板就会得到更精确和准确地校准。当然，误差在校准过程中适当的传导。

Marisa Wong，奥克兰儿童医院（Oakland Children's Hospital）：
    我通过同一块板上的三个重复样品的平均偏差来平衡intra-assay孔间差。在同一实验中，每一块板上重复同一系列标准参照来平衡批间差。

Xiuling Zhang，纽约州卫生署（New York State Department of Health）Wadsworth Center：
    我们通过用相同样品平行重复两次或者更多，计算平均Ct、标准偏差和变异系数，从而衡量孔间差。定量PCR实验中，每个样品平行重复两次或者三次，假如循环数（Ct）在两次或者三次反应之间的差异小于0.5的话，我们认为变异可以接受，直接用平均Ct作为结果。

实时定量PCR操作要点之四：选择做定量PCR时，需要注意哪些因素？

Cristina Hartshorn，美Brandeis大学生物学：
    我想细心的引物设计对于得到专一高效的模板扩增反应来说是十分必要的。研究人员可以利用新出的改进型软件程序来达到这个目的。我们实验室专注于高质量PCR （high-quality PCR）的研究，并已经设计了一系列防止错配和引物二聚体发生的试剂(Elixirs, 专利申请中)。我们一般最后用测序来证实扩增子（amplicon）的特异性。因为我们采用LATE-PCR 和RT-LATE-PCR，产生的扩增子是单链的，测序尤为方便。

Jim Huggett，英国伦敦大学学院（UCL）：
    我们的多数工作是在发展中国家开展的，那里的实验室缺乏高科技设备，要求研究人员在几乎没有怎么经过训练的情况下操作各种需要实验技巧的工作。因此我们的定量方法很简单：用已知拷贝数的标准做“绝对定量”，得到大概的拷贝数——这种方法对于非分子生物学专业的人来说比较容易掌握。此外，通过做出标准曲线，我们能自动的将实验分析效率的评估整合到报告的结果中去——这是当简单处理delta-Ct时通常会忽略的因素。

Tim Hunter，佛蒙特州大学（University of Vermont）癌症中心：
    实验室通常根据待检测的类型和需要考虑的因素来决定选择哪一种定量系统。比如，要定量一种组织样品中的细菌量，通常会选择定量PCR的标准曲线法。根据已知的拷贝数产生的标准曲线，作为“绝对定量”的标准来衡量未知样品中的目标数量。这里，实验的灵敏度——也就是检测低拷贝的下限（甚至低至单拷贝）——是关键因素，灵敏度高才能检测极为微量的细菌含量。

    当为基因表达分析实验选择一种定量方法时， 往往需要确定目的基因和看家基因的扩增效率是否相近，当二者的PCR效率不能匹配因而无法比较定量的Ct值时，就需要重新设计引物，或者采用一些相关的定量方法，通过产生相对标准曲线来弥补扩增效率的差异。

Mikael Kubista，Professor, R&D TATAA Biocenter主任：
    定量方法的选择在很大程度上取决于我们的研究目的。由纯化模板或者PCR产物很容易得到标准曲线，但它们不是十分的可靠，因为没有考虑到基质效应（matrix effect）。假如需要确定一种样品中某种mRNA的量，应该加入以体外转录的目标mRNA为标准溶液，以标准添加法 ( Standard Addition Method )进行定量。在模版足量的前提下系列稀释来减低基质效应。这种方法的问题是反应体系中污染物也会被稀释，导致PCR效率随之改变。对于相对定量反应，当一个定量实验中有一对作用相反的基因，其相对表达量能够被非常准确地测量，可能成为疾病标志物(Ståhlberg et al.2003)。只有一种报告基因，它的表达量需要用一种或者更多已验证的参考基因来平衡(normalized)。可以借助一系列的对照基因组和软件（如GeNorm）来进行分析。假如实验目的只是对样品归类，如疾病的阴性/阳性诊断，最好是检测多个报告基因的表达（不需要用参考基因），用基于表达模式的分类方法进行判断（如GenEx软件）。

Jo Vandesompele，根特大学医院（Ghent University Hospital）医学遗传学中心：
    在验证相关的分析方法和评估过样品的质量后，我们首先要做的步骤是确认候选的参考基因，另一个重要因素是尽可能减少实验偏差，这通过“样品最大化”设置很容易实现——所谓“样品最大化”是指将全部或者尽可能多的样品放置到同一块板中。与此相反的另一种实验设计思路是在同一块板上放置尽可能多的不同基因以进行同时检测，这就需要设置适当的批间校准来平衡不同批次实验之间的差异。在实验后，我们会用我们的免费软件qBase处理数据，这个改良的方法是基于已经确证过的delta-Ct方法，内置基因特异的效率修正和多参考基因的平衡化。

Marisa Wong，奥克兰儿童医院（Oakland Children's Hospital）：
    我认为定量方法的选择主要是实验人对数据的偏好。例如，一些人觉得很难理解或者表达得到的Cts数据，因此更倾向于利用标准曲线。

Xiuling Zhang，纽约州卫生署（New York State Department of Health）Wadsworth Center：
    首先要考虑的是定量研究的目的——是检测绝对的拷贝数还是相对的拷贝数。
    第二要考虑是否需要标准参照和所用的标准的类型。
    第三要考虑打算利用什么标准化的因素（normalization factor）。
    第四要考虑定量实验的细节，如引物设计和防止DNA污染物等。

实时定量PCR操作要点之五：选择什么样的标准和模板？

Cristina Hartshorn，美Brandeis大学生物学：
    在我做的基因表达研究中，我总是选择在目标基因外显子内部设计引物对，这样在PCR过程中基因组DNA和cDNA序列的扩增产生相同的产物。这种策略使我能够通过稀释商品化基因组DNA进行定量得到标准曲线，通过比较来确定样品中模板的数量。PCR的效率对于标准品和未知样品来说是一样的，因为用于扩增的引物和模版在两种情况中是一致的。

    这种方法对于没有内含子的基因和有内含子基因都同样可用，其优点包括无需额外的实验就可以定量RNA和DNA；在无表达的情况，DNA的存在对于证实PCR实验本身没有问题是十分有用的；因此，再加上DNase处理会带来的问题，我更趋向于保留样品的DNA，同时扩增RNA(cDNA)和基因组DNA，然后从这种“总的模板拷贝”消减去基因组DNA的拷贝数，从而计算出mRNA拷贝数。基因组DNA的拷贝数可以通过分析与“经过逆转录的样品(+RT)”相平行的 “未经逆转录反应的样品(No RT)”样品来检测得到，但在研究单个细胞的时候不需要这样做，因为单个细胞的基因拷贝数是已知的。此外，基因组DNA的存在可以证实细胞被成功转移到试管，证实不是人为操作失误造成无表达的结果。(see Hartshorn et al.,2004, for more details).

Jim Huggett，英国伦敦大学学院（UCL）：
    我们在所有的定量实验中都使用标准品（报告中使用绝对拷贝数）。我们的模板是克隆到载体上并线性化的模版。为了使得实验条件尽可能的相似，我们在全部反应（包括参照、标准品和未知样本）中添加了250 µg/ml tRNA。

Tim Hunter，佛蒙特州大学（University of Vermont）癌症中心：
    我们通常利用标准品获得标准曲线来确定未知样品的量。标准品的选择根据研究目的和需要的精确度决定。我们常使用已知拷贝数或者分子数的质粒得到绝对标准曲线。对于相对定量来说，我们常选择靶标基因高表达的样品进行提梯度稀释（覆盖３到６个对数级，取决于所需要的灵敏度）。我们过去也利用浓缩的PCR产物作为标准品，但要特别提醒使用这种方法的人们尤其需要谨慎，因为这种方法很容易污染你工作的地方或者工具。因此我们很少利用PCR产物作为标准品。

Mikael Kubista，Professor, R&D TATAA Biocenter主任：
    在定量实验的过程中我们利用标准品作为质量对照。因此，纯化的PCR产物可以作为标准品。但纯化的模板不是十分适合的标准品，这是由于与在首轮PCR中占支配优势的天然模板相比，PCR产物短，并且导致扩增效率不同。线性化的质粒是一种更好的选择，但仅合适DNA定量。对于RNA定量来说，利用RNA标准品更优。通用参照RNA（Universal Reference RNAs）是一种选择。我们密切关注External RNA Controls Consortium的工作，他们正在验证140种对照序列，其中部分是人工合成的。

Jo Vandesompele，根特大学医院（Ghent University Hospital）医学遗传学中心：
    在自动化流程进行silico qPCR分析的评估中，我们通过标准品来确定qPCR分析的效率。我们利用系列稀释的基因组DNA或者Stratagene 公司的QPCR Reference Total RNA（从每个实验64ng到0.0625ng）进行三重平行实验。为了尽量减少试管对低拷贝数模板的吸附，泊松样品效应（Poisson sampling effects）和自动水解，我们在10 ng/µl λ噬菌体载体DNA里稀释模板。显然，基因组DNA标准品只能用于引物对不跨越内含子的情况下。通常我们也尽量这样设计引物，因为这就可以利用基因组标准品，在未知基因是否表达的情况下还可以用于直接验证PCR反应条件本身是否成功。

    最近，我们也有利用长链寡核苷酸序列作为标准品模板，同样也要稀释在载体DNA中。

    在利用系列梯度稀释方法来决定PCR效率的时候，需要指出的是：尽管这种方法仍然被当作金标准，几乎没人去计算评估效率的错误，或者在下游计算的不确定性。有趣的是，这公式本身清楚地指出怎样尽可能减少误差：扩大稀释度和建立更多的稀释点。我们那个免费的自动qPCR数据分析管理软件qBase能计算这种误差，用用于进一步的计算。

Marisa Wong，奥克兰儿童医院（Oakland Children's Hospital）：
    我的每一个实验都要设立标准品，这种标准品通常是源于cDNA的模板、包含目标区域的扩增产物。   

 本文并非要提出最佳或者正确的定量PCR之路，到目前为止也不存在全球公认的定量PCR标准。急于寻找“标准方法”的读者看完可能还是觉得依然云里雾里。研究方法从来没有最好，只有最适和自己实验的方法。他山之石可以攻玉，看看定量PCR老手们的不同见解，国外实验室的一些常用做法，对于想深入考究定量方法的人来说是有益的，对于只想快快借助定量PCR拿到一个结果，恐怕要失望了。