功能基因组学研究新方法——双色红外荧光检测技术

基因组序列的迅速获得推动了一门新兴学科——功能基因组学的发展，这一学科重点关注基因功能的变化。扩增性片段长度多态性（Amplified restriction fragment length polymorphism，AFLP）分析以及反向遗传学都是功能基因组学的重要组成部分。
　　传统的反向遗传学，例如用转座子（transposon）敲除特定基因，虽然可以准确测定表型，但需要进行耗时的转基因或复杂的组织培养。而且由于这种基因敲除的方法将整个基因敲除，无法观察到活性基因功能部分缺失的结果。
　　为克服此基因敲除方法的局限性，进一步获得关于活性基因突变的信息，Fred Hutchinson癌症研究中心的研究者们发明了一种定向诱导基因组局部突变（TILLING： Targeting Induced Local Lesions In Genomes）技术。该方法具有简单高效的特点，它利用化学突变方法来获得所有基因的传统的点突变等位基因系列。对那些表型分析时会牵涉到亚致死等位基因的重要基因，TILLING的方法具有其独特的优势。随着TILLING方法有效应用到越来越多的生物种类，如果蝇，拟南芥，斑马鱼，玉米等，它在遗传学研究方面的重要价值也越发体现出来。
　　但由于点突变一般很难被检测出来，一直是TILLING技术应用上的一个障碍。要得到好的结果，要求检测仪器不仅灵敏度高，还能够识别假阳性位点。我们在这儿给大家引荐一种更简便，灵敏，准确的高通量TILLING分析技术：双色红外荧光检测技术。
　　双色红外荧光检测技术是美国LI-COR公司的专利技术。LI-COR长期致力于此项技术在生物学研究中的应用，他们开发的Odyssey双色荧光扫描系统及DNA遗传分析系统都取得了很大成功。由于杂质、干扰分子在红外区几乎不发光，用红外荧光进行检测的背景非常低，灵敏度很高，可检测到低达15amoles的荧光分子。加上双通道检测（680nm激发，710nm检测；780nm激发，820nm检测），两个通道检测波长相距110nm，相对于通常的可见荧光四色检测来说，几乎没有光谱重叠的干扰（见下图），保证了TILLING分析中每一个突变碱基的准确识别及整个检测的灵敏度。
　　以下就具体给大家介绍双色红外荧光检测技术在反向遗传学中与TILLING法结合的应用，及基于双色红外荧光检测技术的LI-COR 4300 DNA分析系统与之相应的技术优势。

红外荧光检测技术在反向遗传学中的应用
　　将红外检测技术同TILLING技术结合，其优势已经被全世界许多实验室证实。美国国家科学基金会植物基因组计划（NSF Plant Genome Research Program (PGRP)）近年来大力发展高通量TILLING，并直接推动了以美国为首的北美实验室联合启动拟南芥 TILLING项目（ATP：Arabidopsis TILLING Project）。该项目组使用 LI-COR DNA 分析系统在其成立的第一年就为拟南芥研究者们提供了100多个基因上的1000多个突变位点。本文就以此为例来介绍红外荧光检测技术在反向遗传学中的应用。
1　对拟南芥种子进行诱导处理产生一系列点突变
2　将种子培养，获得第一代拟南芥突变个体
3　第一代植株自花授粉，产生第二代
4　将第二代植株种子收集，抽提DNA，存放于96孔板
5　将多个96孔板的样本合并到1个96孔板内（最多可合并8个），用两对特异性引物进行PCR扩增，两对引物分别用700nm和800nm荧光染料标记。
6　对拟南芥种子进行诱导处理产生一系列点突变
7　将种子培养，获得第一代拟南芥突变个体
8　将第二代植株种子收集，抽提DNA，存放于96孔板
9　分别得到700nm和800nm两张图。发生突变的泳道，在700nm的图上可以在野生型条带下方看到一个条带，同时在800nm的图上相同的泳道也会有一个条带，这两个条带就是CEL I核酸酶的剪切产物，两个条带片断大小之和等于扩增片段的大小，从而很容易对扩增产物进行突变检测
10　当混合样本检测到突变后，要对混合样本中的每个DNA样本再次进行筛选，检测出发生突变的DNA样本。

TILLING技术路线
技术关键一：获得高质量的TILLING图像
　　将红外荧光检测技术与TILLING技术结合后，可以同时获得两张真实的电泳图像（700nm和800nm）。应用TILLING技术时，获得未经修改的图像原始数据对于检测的灵敏度和准确性都很重要。如果检测系统在检测时对荧光数据已经进行了处理，很可能会过滤掉大部分甚至是全部的突变信息。
技术关键二：双色成像能有效排除假阳性突变
　　通过PCR反应得到的异源核酸双链分子在碱基错配处被切断。由于两个剪切片断采用不同的荧光染料标记，如果真的发生了突变，双色检测时将在野生型条带下面出现两个突变条带，分别位于700nm和800nm电泳图的同一泳道。同时，这两个突变条带的分子量之和应该等于野生型条带的分子量，因而双色检测能够有效排除假阳性点突变，准确度很高。
技术关键之三：高灵敏度的红外检测
　　由于核酸外切酶活性会导致一些信号丢失，应用红外检测技术提高灵敏度对于TILLING检测非常重要。红外荧光检测相对可见光检测具有背景低、灵敏度高的优点。此外，结合红外荧光染料后，该检测方法还具有另一个优点——宽广的线性范围。这一特点使得强信号和弱信号能够同时被分辨，当野生型条带的信号强，突变型条带信号弱时，LI-COR DNA分析系统也能够轻松识别突变。

高通量的突变筛选
　　结合4300分析系统，TILLING作为一种高通量的筛选技术，其通量可达到：
   每块胶可检测750，000碱基对
   每天可检测2000样本
   每天可检测2百万碱基对
   每个样本可检测1000个碱基

应用Tilling 技术发表的一些文献：
1. Till, B.J., Reynolds, S.H., Greene, E.A., Codomo, C.A., Enns, L.C., Johnson, J.E., Burtner, C., Odden, A.R., Young K., Taylor, N.E., Henikoff, J.G., Comai, L., and Henikoff, S. 2003. Large-Scale Discovery of Induced Point Mutations With High-Throughtput TILLING. Genome Research 13:524-530.
2. Henikoff, S., and Comai, L. 2003. Single-Nucleotide Mutations for Plant Functional Genomics. Annual Review of Plant Biology. 54:15.1-15.27.
3. Colbert, T., Till, B.J., Tompa, R., Reynolds, S., Steine, M.N., Yeung, A.T., McCallum, C.M., Greene, Comai, L., and Henikoff, S. 2001. High Throughtput Screening for Induced Point Mutations. Plant Physiology 126: 480-484.
4. McCallum, C.M., Comai, L., Greene, E.A., and Henikoff, S. 2000. Target Induced Local Lesions In Genomes (TILLING) for Plant Functional Genomics. Plant Physiology 123:439–442.

红外荧光检测技术在AFLP研究中的应用
　　除了以上提到的反向遗传学中的应用外，红外荧光检测技术在AFLP研究中的应用也日益广泛。该领域的许多文章都使用LI-COR DNA 分析系统完成。LI-COR公司针对 AFLP研究提供包括试剂、仪器、分析软件在内的全套AFLP分析解决方案，不仅能进行传统的基因组AFLP分析，还提供专门的试剂盒进行表达性的cDNA AFLP分析，如果结合LI-COR的Odyssey红外荧光扫描成像系统，还可将AFLP电泳条带回收进行进一步的研究，为研究者提供了极大的便利。分析软件方面，LI-COR公司秉承了其“功能细致强大，自动化程度高”的一贯优点，仅针对AFLP一项就有Gene ImagIRTM, SAGAMX, AFLP QuantarTM Pro三种不同的软件，分别满足一般性用户、专业用户和特殊的共显性分析的需要，彻底解决了数据分析的瓶颈制约。

AFLP相关文献：
1. Identification on Commercialized Products of AFLP Markers Able To Discriminate Slow- from Fast-Growing Chicken Strains。OLIVIER FUMIEÅ RE,*,† MARC DUBOIS,† DIMITRIE GREÄ GOIRE,† ANDREÄ THEÄ WIS,‡ ANDGILBERT BERBEN†J. Agric. Food Chem. 2003, 51, 1115-1119
2. High-Throughput AFLP® Analysis Using Infrared Dye-Labeled Primers and anAutomated DNA Sequencer. A.A. Myburg, D.L. Remington, D.M. O‘malley, R.R.Sederoff, and R.W. Whetton. BioTechniques 2001, 30(2): 348-357.
3. Construction of an AFLP® genetic map with nearly complete genome coverage in Pinus taeda. D.L. Remington, R.W. Whetten, B.-H. Liu, D.M. O‘Malley.Theoretical Applied Genetics 1999, 98:1279-1292.　
4. NA Inter-MITE polymorphisms (IMP): a high throughput transposon-based genomema pping and fingerprinting approach. R.-Y. Chang, L.S. O‘Donoughue, and T.E. Bureau. Theoretical Applied Genetics 2001, 102:773-781.