广谱流感疫苗

由于科学家们鉴定到了流感病毒表面蛋白的稳定结构域，我们期盼了数十年之久的通用流感疫苗终于有望问世了。

在2009年全世界的目光都被吸引到亚洲禽流感疫情的时候我们却都忽视了另外一个问题，在地球的另一面也有一个幽灵正在接近，那就是在墨西哥和美国加利福尼亚州爆发的H1N1流感大流行。这株流感病毒就是导致1918全球大流感的那株，它已经在猪体内隐藏了一个世纪，现在又出来为祸人间了。由于大部分人对这株病毒都没有免疫力，所以全世界都被它吓了一跳。

为了对付这场流感疫情，科学家们花了好几个月的时间研制相应的疫苗，但这对于流感来说已经太长了，这场流感爆发的高峰出现在2009年得3月，然后在11月初又露头了一次。美国田纳西州孟斐斯St Jude儿童研究医院（St Jude Children’s Research Hospital in Memphis, Tennessee）的病毒学家Robert Webster一直在追踪流感病毒，并且为流感疫苗开发工作提供指导意见，据他介绍，幸运的是这株病毒的毒性并不太大，所以没有给我们造成太大的伤亡。如果H5N1流感病毒能够在人群中传播那真是只有上帝能搭救我们了。因为到时候一夜之间所有的抗流感病毒药物都将消耗殆尽。

2009年爆发的这两场流感疫情又重新激活了流感疫苗的研发工作。而且因为这种流感病毒和普通的季节性流感病毒不同，它们之间的交叉反应性更强，可以刺激人体产生出保护范围更广泛的中和抗体，所以开发这种疫苗的价值更大，而且更重要的是科学家们已经找到了方法。甚至还有一位病人体内产生了可以让所有16种甲型流感病毒（influenza type A virus）毒株全都失活的抗体，他们将这种抗体称作“F16抗体（FI6 antibody）”。甲型流感病毒是毒力最强的流感病毒，它们也是导致历次流感大流行疫情的罪魁祸首。

但是这种情况毕竟非常少见。瑞士贝林佐纳（Bellinzona, Switzerland）生物医药研究所（Institute for Research in Biomedicine）的免疫学家Antonio Lanzavecchia一共从8名志愿者身上提取了10.4万份B细胞样品进行筛查，结果只发现了一株B细胞可以产生F16抗体。这种F16抗体可以与所有16株不同甲型流感病毒毒株的血凝素蛋白（hemagglutinins）结合，其中就包括了H1N1禽流感病毒和H5N1禽流感病毒以及比较常见的H3N2流感病毒。从理论上来说，这种F16抗体为设计流感通用抗体提供了一份很好的设计蓝图。Webster表示，他们一直在找这样一种抗体，现在看来我们似乎已经找到了针对流感病毒的‘必杀技（Holy Grail）’。

稳定的靶点

流感病毒可以说是一名技艺高超的棋手，它们在和人体免疫系统的对弈中往往都会是赢家。在流感病毒表面有两种主要的蛋白，血凝素蛋白和神经氨酸酶蛋白（neuraminidase）。其中血凝素蛋白起到了两个非常重要的作用，它与流感病毒和宿主细胞的融合有关，同时它球形头部上的环状结构也可以充当很好的诱饵。对于抗体来说，每一个病毒都好像是在表面覆盖了一层茂密的热带雨林一样，而从每一颗大树树顶伸出的自由氨基酸链就是抗体的结合位点。但是这些位点会快速突变，能够迅速改变形状。所以人体免疫系统针对一种流感病毒产生的抗体就只能识别这种抗体的结合位点，不能识别其它流感病毒的结合位点。

因为现有的流感病毒疫苗都是通过模拟天然流感病毒感染过程来发挥保护效力的，所以它们也都存在上述结合位点的限制问题。虽然我们体内可能也会产生一定的“广谱”中和抗体，但它们的数量非常少，绝大多数抗体还是特异性抗体，所以我们大多数人每年都得接种一次流感疫苗。

要解决这个问题只有让我们的免疫系统重新选择识别靶标，最好能够认识这些大树的“树干”，即血凝素蛋白上稳定性较高的部分，是不管病毒怎么突变，这部分氨基酸都不会改变的部分。F16抗体和绝大多数有交叉反应性（cross-reactive）的抗体让我们看到了希望，引领我们向着这个目标挺进。瑞士诺华制药公司（Novartis）的疫苗开发部经理Rino Rappuoli指出，这是他们第一次发现可以中和每一种流感病毒毒株的抗体。但是，尽管F16抗体可谓是疫苗开发史上的里程碑式的发现，但Rappuoli还是不敢轻易说我们找到了开发通用疫苗的关键。他指出，他们现在还是不知道怎么开发通用疫苗，但他相信这个目标很快就会实现的。

问题的根源

如果我们手上有了广谱的抗体，那么它主要可以用在两个方面，一是可以用于其它治疗方法无效的流感患者进行被动免疫治疗（passive immunization），二是可以作为模板开发出相应的疫苗产品。相比之下第二点要困难得多，因为这需要对抗体进行非常精细的研究，根据抗体的构象设计出可以与之结合，并且可以很好地刺激人体免疫系统，产生通用抗体，达到免疫保护效果的蛋白质疫苗。所以很多人都愿意开展第一种应用。Lanzavecchia表示，这种抗体很有效，它的保护效果非常广，而且这种人源性的抗体再注射给病人也不会造成过敏的问题。坦率地说，我们就是想拿来当做药物使的。

美国马里兰州贝塞斯达国家过敏症与传染病研究所（National Institute of Allergy and Infectious Diseases, NIAID）疫苗开发中心的主任Gary Nabel也表示开发通用疫苗的确有难度。他指出，他们曾经尝试过开发HIV病毒的通用疫苗。这事说起来容易，做起来可不轻松。现在的问题就在于如何开发出这样一款能够刺激人体产生这种特异性的、非天然免疫保护反应的疫苗。即便我们找到一个可以刺激人体免疫系统产生特异性抗体的蛋白质，在人体内抗体还是有很多种途径和这个位点结合。据Nabel介绍，很明显，这是众多感染性疾病都面临的一个普遍问题，流感病毒只不过是其中的一个典型代表。一旦他们掌握了其中的诀窍，就可以针对各种感染性疾病开发出各种各样的疫苗产品。

虽然开发这种可以“识别树干”的人体疫苗非常困难，但也不是完全不可能的。Nabel和他的科研团队就率先使用了一种叫做“初次免疫再加强（prime-boost approach）”的免疫方法达到了这一目的。这种免疫方法也可以算作是联合免疫，会给人体先后接种两种不同的疫苗，这样就可以刺激人体产生较强的免疫反应，而且保护的范围也比较广，包括H5N1病毒、H5N2病毒和H9N2病毒。第一次接种的是DNA疫苗，这是一种由细菌环状DNA组成的小分子疫苗，这种DNA可以编码针对一株流感病毒血凝素蛋白的特异性蛋白质。24周之后再接种一次灭活的H5N1流感病毒疫苗，这样就能起到加强免疫的效果。在试验中发现有3名志愿者体内产生了可以识别血凝素蛋白主干的广谱中和抗体。Nabel认为他们的研究表明开发广谱流感疫苗是可行的。

美国纽约西奈山医学院（Mount Sinai School of Medicine）微生物学家Peter Palese实验室里的小鼠就已经接种了这种流感疫苗，而且达到了很好的免疫保护效果，各种流感病毒都没能感染上这些实验小鼠。Palese发现有两种血凝素蛋白截短体的免疫保护效果要比全长血凝素蛋白更好，其中一种截短体是截去了头部的血凝素蛋白，另一种截短体是不完全表达的血凝素蛋白，但它们还不是免疫保护效果最好的，它们只能预防H3型流感病毒的感染，对H1型流感病毒的预防效果就比较差。同时，Palese还和其他从事动物实验的研究人员持有同样的观点，即小鼠实验虽然结果非常好，但小鼠毕竟不是人，不能由此断定这些疫苗在人体上也能达到同样好的保护效果。

虽然如此，全世界的科学家们和疫苗生产商们还是没有放弃，依然在努力工作着。由于高通量筛选技术的发展，科研人员们现在可以对每一位志愿者（不论是健康志愿者还是流感病毒感染者）的每一株B细胞进行筛选，找到那罕见的F16抗体分泌细胞。2008年，荷兰Crucell公司的一个研究小组第一个在人体内发现了可以中和所有流感病毒的广谱抗体。此后他们除了继续生产这种抗体用于被动免疫治疗之外也开始尝试利用流感病毒的保守结构域免疫啮齿类动物，开发预防性疫苗的工作。

通常情况下，我们人体的免疫系统都会忽略流感病毒的主干结构，因为这部分结构都“隐藏”得比较深，很难被体内的免疫系统所发现，所以人体的免疫系统只能够识别流感病毒表面暴露在外的蛋白质头部，进而产生各种相应的抗体。但是绝大部分的广谱中和抗体却主要都是识别保守的主干结构域。Crucell公司就打算重建这个保守区域，然后作为疫苗刺激人体免疫系统，产生广谱的中和抗体。所以选对合适的抗体结合结构域是事关整个疫苗开发工作成败的关键，不然的话我们就还是只能得到特异性的疫苗（抗体）。Crucell公司的免疫学家Katarina Radosevic解释，他们已经知道如何重建一个主干结构域了。但目前的问题在于如何得到稳定的结构域蛋白，这太难了。他们不可能将蛋白的一个部分切掉，同时还能够保证剩余的部分可以很好地折叠，保持稳定的构象和功能。

受体结合位点

最近，科学家们又发现了一个新的可以用于制备广谱疫苗的靶点，这也是一种保守的结构域，但它好就好在并不是隐藏在蛋白质结构的深处。这就是位于血凝素蛋白球状头部最顶端的受体结合结构域（Receptor binding pocket），流感病毒就是通过这个位点感染人体宿主细胞的。该结构域的结构在所有16种流感病毒毒株上全都大同小异，彼此之间只有细微的修饰区别。但是这个结合位点非常小，比普通的抗体小得多。所以没有人认为它会是一个好的疫苗候选分子，但从目前的情况来看它很有可能就是我们一直在寻找的靶标。

为了了解人体的免疫系统在接种了季节性流感疫苗之后是如何工作的，美国北卡罗来纳州达拉谟杜克大学（Duke University in Durham, North Carolina）的研究人员对接种了数次季节性流感疫苗的志愿者进行了抗体采样分析。其中有一种抗体叫做CH65，它似乎比其它抗体的保护效果要好一些。于是杜克大学的科研人员将这一消息告诉了美国哈佛大学医学院（Harvard Medical School）和美国马萨诸塞州波士顿市儿童医院（Children’s Hospital in Boston, Massachusetts）的结构生物学家，供他们分析。结果Harrison表示，分析结果让他们大吃一惊，因为这个抗体就是与血凝素蛋白受体结合位点相结合的抗体。而且它们之间的氨基酸结合位点有一半都位于这个受体结合位点之内，这个结合程度实在是太让我们吃惊了。”

而且就算这个结合位点周围的氨基酸位点发生了点突变也丝毫不会影响该结合位点与抗体之间的结合能力。于是科学家们将过去30年间流行的36株H1型流感病毒毒株全都拿来进行了测试，结果发现这种抗体可以与其中的30株病毒结合。Harrison介绍，这些流感病毒经过了将近30年的进化，但是还是没有逃脱这株抗体的中和。可见几乎不太可能有什么突变能够影响这株抗体的结合能力了。同时，Harrison还提出了另外一种可能，即自从1977年以来没有多少人体内产生过这种抗体，所以现存的流感病毒都不是它的对手。

其实Harrison对开发广谱流感病毒疫苗的研究兴趣并不是那么大，他还对抗体与受体之间亲和力成熟度（affinity maturation）的基础机制研究非常感兴趣。所谓的亲和力成熟度，指的是当人体免疫系统多次接触同一（略有差异）抗原时会产生多种抗体，其中就会有一些抗体与抗原的亲和力更高，这就是亲和力成熟度。但是为什么抗原上发生一点小小的变化就能够让免疫系统产生完全不同的反应呢？我们该如何利用这种现象呢？

当一部分科研人员正忙于寻找血凝素蛋白保守结构域的时候，另一部分人却还在深入挖掘已经沿用了好多年的流感疫苗靶标的潜力。这其中就包括流感病毒通道蛋白M2和基质蛋白M1，以及帮助病毒维持基因组稳定性的核蛋白（nucleoprotein）。Rappuoli介绍，这些保守蛋白我们至少已经认识它们20年了。但到今天为止，我们也只能说从理论上它们可以用于开发广谱流感疫苗，但这仅仅是从理论上来说，在现实科研工作中我们还是没有取得哪怕一丁点的进展。

不过，还是有很多生物技术公司盯着这些靶点不放。比如美国新泽西州克润贝蕊市（Cranbury, New Jersey）的VaxInnate公司就合成了一种杂交分子，其中就包含有四个拷贝的M2e（M2离子通道蛋白位于病毒表面的组分）和一个融合的细菌鞭毛蛋白（flagellin）。VaxInnate公司最近报道说这款名为Vax102的疫苗可以在人体内诱发免疫反应，有可能对所有的甲型流感病毒都有免疫保护作用，而且还非常安全。美国加利福尼亚州柏克莱（Berkeley, California）DynaVax公司也同样选择了M2e蛋白，不过他们是将M2e蛋白与流感病毒核蛋白进行了融合，他们将这种人工蛋白命名为N895。DynaVax公司希望N895可以刺激人体免疫系统产生针对M2e蛋白和流感病毒核蛋白这两个靶点的免疫保护力。法国里昂（Lyon, France）赛诺菲巴斯德公司（Sanofi Pasteur）在英国剑桥（Cambridge）的子公司Acambis也开发了一款M2e疫苗，并且他们还在2008年为这款疫苗开展了I期临床试验，结果发现这款疫苗对甲型流感病毒的预防效果非常好，而且人体的耐受度也很高。Acambis公司还开展了另外一项研究，结果发现有70%接种过该疫苗的雪貂都可以免受禽流感的感染。

但我们到目前为止也就取得了上述这些成果，没能再继续深入下去了。赛诺菲巴斯德公司现在还在犹豫要不要继续为这款疫苗开展II期临床试验。该公司研发部门的副总经理Jeffrey Almond认为，单单使用M2e这一个靶点开发的疫苗其效果不可能比现有的季节性流感疫苗更好。所以他们可能会稍微缓一缓，看看还能再往这款产品里加点什么。因为他们相信作为一款广谱的疫苗产品，它不可能是由一种靶点组成的。与此同时，美国新泽西州的默克公司也暂停了他们的临床试验项目。

另辟蹊径

实际上还有一种开发广谱流感疫苗的办法，那就是想办法激活人体的T细胞免疫（细胞免疫反应），而不是想办法刺激人体产生广谱抗体（即体液免疫反应）。抗体可以保护人体免受流感病毒的感染，但T细胞可以通过杀死被感染人体宿主细胞的方式帮助人体清除已经进入人体内的流感病毒。这也就是英国牛津大学疫苗研发机构——詹纳研究所（Jenner Institute based at Oxford University in the UK）的疫苗开发人员Sarah Gilbert正在使用的思路。Gilbert使用了一种减毒的痘病毒（poxvirus）MVA做载体，让它表达流感病毒的核蛋白以及M1蛋白，刺激人体的免疫系统。结果他们发现了非常强的T细胞免疫反应，而且每一个接种该疫苗的人体内都能产生很强的T细胞免疫反应。这种T细胞介导的免疫反应可以为我们人体提供另外一条抵御流感病毒的防线，如果再和针对流感病毒血凝素蛋白主干结构域的疫苗联合使用效果将更好。Gilbert一共邀请了22位志愿者进行了实验，其中11名志愿者接种了疫苗，另外11名作为对照。然后采用滴鼻的方法用H3N2病毒对他们进行了感染，最后检测这些志愿者体内的T细胞免疫反应强度以及他们的流感症状。

实验发现，如果将Gilbert的疫苗和季节性流感疫苗联用，那么不仅能激活细胞免疫反应，同时也能够激活体液免疫反应。如果只接种一次季节性流感疫苗，那么在年轻志愿者中就能产生很高滴度的抗体，但是在老年志愿者中的效果就要差一些。Gilbert认为，如果给老人使用两种疫苗效果会好很多。其实季节性流感疫苗对老年人的免疫保护效果一直都不怎么好，这是因为老年人的免疫反应消退得比较快的缘故，而且随着年龄的增大，他们产生抗体的能力也会随之降低。Gilbert解释，他们的疫苗只不过起到了一个强化的作用，他们的疫苗并不能激活一个新的免疫反应。即便他们成功开发出了一款广谱流感疫苗也还是不能解决老年人免疫保护效果差的问题。所以我们不可能开发出一款只需要给每人接种一次就可以确保他们一生平安的流感疫苗。Rappuoli指出，问题在于‘广谱’的定义是什么。是覆盖所有的流感病毒毒株吗？这几乎是不可能的。但这却可以当做一个激励我们不停前进的科学目标。

 
原文检索：
Jana Schlütter. (2011) Vaccine for all seasons. Nature, 480:S6-S8.
YORK/编译