氨基酸TW-PCD2000柱后衍生设备检测方案书

氨基酸TW-PCD2000柱后衍生设备检测方案书

介绍

柱后衍生技术可以改善灵敏度，提高选择性(减少干扰)，降低检测限。泰特仪器柱后衍生使用离子交换钠柱来测定蛋白质水解产物中的氨基酸，使用离子交换锂柱检测天然产物中的氨基酸。氨基酸柱后衍生的检测有两种手段。可以使用茚三酮试剂，来检测一级和二级氨基酸，或者使用邻苯二甲醛(OPA)，荧光检测，检测灵敏度更高，但只能分析一级氨基酸。

完全的柱后衍生系统包括如下部件：

1.HPLC 梯度泵

2.带高pH 相容性的Tefzel 或者PEEK 密封的手动进样器或者自动进样器

3.离子交换柱

4.柱后衍生仪器TW-PCD2000

5.洗提液，试剂和标准物

6.可见或荧光检测器

7.图谱记录，积分和数据系统

背景

分离包括多种机制：离子交换、离子排阻、分配。主要过程为阳离子交换，pH 梯度将氨基酸调整至等电点。酸性氨基酸例如：谷氨酸，出峰时间早；碱性氨基酸例如：赖氨酸，出峰时间晚。分配机制受离子强度与有机修饰剂的影响。例如：苏氨酸和丝氨酸的分离依靠分配基质。离子排阻作用发生在强酸性氨基酸，例如：牛磺酸。

使用阳离子交换色谱柱可以快速分析水解蛋白质或者组成简单产品中的22 种氨基酸。锂离子交换柱分析时间长、但可以得到更高的分离度，可以分离复杂生物体液和组织提取物中的46 种氨基酸和化合物。

柱后衍生最常用的检测试剂为茚三酮。茚三酮与一级氨基酸反应，生成的还原茚三酮形成Ruhemann’s 紫色的荧光（如下图）,可在570nm 被检测出。茚三酮与二级氨基酸反应生成黄色复合物，可在440nm 出被检测。茚三酮的反应可在130℃，容量为500μL 的反应器中进行。需要提高反应温度，因为在常温下茚三酮的反应很慢。

另一种试剂系统为邻苯二甲醛(OPA)，分析一级氨基酸时产生具有很高的检测灵敏度。在碱性条件下，OPA快速与一级氨基酸和亲核试剂Thiofluor (N,N-二甲基－2 巯乙胺)反应产生带荧光的异吲哚衍生物（如下图）。OPA 不与二级氨基酸和芳胺反应，所以不能检测脯氨酸和其它二级氨基酸。

然而，也有可能先将物质氧化，然后再与OPA 试剂反应，这一技术既有许多缺点，如详细了解请联系武汉恒新世纪科技有限公司。

用于茚三酮法的仪器配置与使用OPA 法基本一致，除了OPA 法反应器的体积为150μL，反应温度为40℃。

基本样品制备

生理液体和蛋白质水解样品的一般制备过程。许多中样品会需要做氨基酸分析。

血浆、尿液、其它生理体液、植物提取物、食物和饮料中的天然氨基酸以“游离”状态存在，对这些样品的制备比水解氨基酸简单，省时。但是调节pH 和浓度，除去可溶氨基酸的过程会色谱图有很大影响。

早出峰的氨基酸－牛磺酸，尿素，苏氨酸，丝氨酸等－对pH 和浓度特别敏感，通常样品的pH 范围必须控制在2.1 和2.5 这一狭小的范围之间，和适当的锂离子浓度来保证重复性。后出峰物质对初始条件更耐受。SERAPREPTM 和URIPREPTM 替代常规使用的蛋白质沉淀剂，例如：乙晴、高氯酸、苦味酸。不用透析、超滤、多重离心。

?  所有样品均用0.45μm 过滤膜过滤，有些样品则可能需要用更细的过滤膜，尤其存在胶体时。

?  样品必须缓冲，进样的理想pH 范围为2.2±0.2。

?  对于天然样品，分析前将所有的蛋白质去掉。

生理体液样品

使用制备SERAPREP 和URIPREP

使用SERAPREP提供高缓冲容量，制备血浆和其它样品。例如：沙丁鱼油。使用URIPREP

提供低缓冲容量制备尿液和其它样品，例如：果汁，瘤。蛋白质沉淀的效率和离心后pH 调整的需要决定了哪种更适合你的样品。

1. 在微离心管中完全混合等量的样品和SERAPREPTM 或者URIPREPTM

2. 静止5 分钟，将混合物以13000rpm 的转速离心5 分钟。

检查上清液pH 值确定pH 范围在2.3±0.2，根据需要调整最初混合比例。

3. 用注射过滤器（0.2 或者0.45μm）过滤上清液，过滤液可放入自动进样瓶进行氨基酸分析。

4. 如果需要进一步稀释，使用Li 220 调整分析物浓度。

试剂准备

1 将945mL OPA 稀释剂（Cat No OD104）倒入试剂瓶，留5mL 第五步使用。

2 盖上瓶盖，打开进气阀，开启气源。使惰性气体喷射满全瓶。持续冒泡10 分钟

3 将300mgOPA（Cat NO O120）溶解于10mL 色谱柱甲醇中。

4 关闭气源，打开瓶盖。将OPA 溶液倒入已经去氧的稀释液中。用1-2mL 的甲醇冲洗残留在瓶中的混合物。

5 溶解2g ThiofluorTM（Cat NO 3700-2000）与第一步留下的5mLOPA 稀释液中并倒入试剂瓶。

6 加入3mL 35%的Brij-35 溶液

7 盖上瓶盖，打开气源，使其喷射几分钟后关闭进气阀。轻轻摇动试剂瓶使其完全混匀。

注意：OPA 试剂对氧敏感，并逐渐降解。Pinnacle PCX 系统减慢它的氧化，OPA 试剂子在惰性气体的压力

下，一周内活性不会明显降低。

柱后衍生条件

这里推荐最常使用的氨基酸分析的柱后条件。HPLC 的条件，参看各段的开头样品色谱与梯度程序。

使用OPA 试剂

试剂1：邻苯二甲醛和ThiofluorTM 于OD104 稀释液中，再加35%Brij-35?

泵1 流速：0.30ml/min

反应器1 体积：500μL

反应器温度：45℃

使用次氯酸钠，然后再用OPA 试剂

试剂1：次氯酸钠于GA116 稀释剂中

试剂2：邻苯二甲醛和ThiofluorTM 于OD104 稀释剂，加35%Brij-35?。

泵1 流速：0.30ml/min 泵2 流速：0.30ml/min

反应器1 体积：500μL 反应器2 体积：100μL

反应器1 温度：45℃ 反应器2 温度：室温

过程

根据色谱柱类型和样品的不同， 推荐6 种不同的梯度条件。

柱温箱的控温程序为方法的优化提高了便利，使用温度梯度可以改善分离，缩短分离时间，调整检测方法。为了保护色谱柱将HPLC 的最大压力设置为220bar，在初始条件下平衡30 分钟。进10μL 氨基酸标样，至少收集三张谱图。第一张谱图放弃不用，使用后两张评估系统。

分析和柱后衍生条件

方法1：生理体液分析，高效锂柱

保护柱：       柱温：38℃     HPLC 流速：0.35ml/min

峰归属

1 磷酸丝氨酸               16 丙氨酸                  31 γ-氨基丁酸

2 牛磺酸                   17 瓜氨酸                  32 色氨酸

3 磷酸乙醇胺               18 α-氨基-n-丁酸           33 2-氨基乙醇

4 尿素                     19 缬氨酸                  34 羟(基)赖氨酸

5 门冬氨酸                 20 胱氨酸                  35 氨

6 羟基脯氨酸               21 甲硫氨酸                36 肌酸肝

7 苏氨酸                   22 胱硫醚                  37 鸟氨酸

8 丝氨酸                   23 异亮氨酸                38 赖氨酸

9 天(门)冬氨酰苯丙氨酸甲酯  24 亮氨酸                  39 组氨酸

10 谷氨酸                  25 正亮氨酸                40 3-甲基组氨酸

11 谷氨酸盐                26 酪氨酸                  41 1-甲基组氨酸

12 肌氨酸                  27 苯基丙氨酸              42 肌肽

13 α-脂肪酸胺              28 丙氨酸                 43 鹅肌肽

14 脯氨酸                  29 α-氨基-i-丁酸           44 α-氨基-β-胍基丙酸

15 甘氨酸                  30 高胱氨酸                45 精氨酸

方法2：使用梯度升温程序分析生理样品，高效锂柱

保护柱：        HPLC 流速：0.4mL/min    初始温度：32℃

柱温程序

方法3：生理体液分析，标准锂柱

保护柱：    柱温：40℃   HPLC 流速：0.30ml/min

方法4：苯丙酮尿病（PKU）与槭糖尿病（MSUD）的快速检测，高效锂柱

保护柱：       HPLC 流速：0.35mL/min     柱温：38℃

方法5：苯丙酮尿病（PKU）与槭糖尿病（MSUD）的检测，高效锂柱

保护柱：      柱温：65℃    HPLC 流速：0.40mL/min

方法6：胶原和蛋白质水解产物分析，高效钠柱

保护柱：      柱温：48℃ HPLC      流速：0.40mL/min

胶原蛋白水解产物

1 蛋氨酸亚砜           8 甘氨酸           15 酪氨酸           22 精氨酸

2 羟脯氨酸             9 丙氨酸           16 苯丙氨酸         23 磺丙氨酸

3 门冬氨酸             10 胱氨酸          17 羟赖氨酸         24 蛋氨酸砜

4 苏氨酸               11 缬氨酸          18 赖氨酸           25 正亮氨酸

5 丝氨酸               12 蛋氨酸          19 氨

6 谷氨酸               13 异亮氨酸        20 组氨酸

7 脯氨酸               14 亮氨酸          21 色氨酸

方法七：梯度升温程序分析胶原和蛋白质水解产物，高效钠柱

保护柱：      柱温：46℃     HPLC 流速：0.40mL/min

色谱柱升温程序

方法八：梯度升温程序分析氧化饲料中硫化氨基酸，高效钠柱

保护柱：      柱温：50℃ HPLC 流速：0.40mL/min

色谱柱升温程序

方法九：蛋白质水解物，标准钠柱

保护柱：       柱温：48℃ HPLC 流速：0.30mL/min

方法十：分析氧化饲料中硫化氨基酸，标准钠柱

保护柱：     柱温：55℃    HPLC 流速：0.40mL/min

注意事项

1.避免皮肤直接接触试剂瓶和吸管，指纹上的氨基酸会造成污染，建议带手套。

2.当离子交换色谱柱和反相色谱柱转换时，在连接色谱柱时一定要用去离子水清洗HPLC 和进样阀。可能一种应用使用的洗提液会影响另外一种的色谱柱或其它配件。

3.使用柱前过滤器或者保护柱来保护分析柱

4.因为洗提液有腐蚀性，建议平时使用时检查色谱柱接头是否泄漏。

5.不要在压力超过2800psi(193bar)的状态下过长时间使用色谱柱。背压高时及时更换可能导致高压的保护柱、分析柱、或者0.5μm线过滤器。

5.注意：过滤器和保护柱的压力应<36bars

6.关闭前用再生液冲洗色谱柱15-20 分钟，将色谱柱中储存在再生液中。

7.拆色谱柱时，用水冲洗接头末端，然后堵上塞，防止腐蚀。

8.污染首先会发生在保护柱，将它们分别冲洗，节省时间。

9.小心离子污染：铁离子和其它多价阳离子、有机染料、油脂、表面活性剂和清洁剂。它们可能导致不可逆的损坏。

10.有机溶剂会使色谱柱中树脂的膨胀，产生高背压和峰形展宽。这种情况下，色谱柱有时可能可以再生。

11.试剂制备过程中必须佩戴手套，OPA 和ThiofluorTM 会皮肤有刺激性。指印会导致试剂污染，TRIONE会使皮肤染色。

12.OPA 试剂遇空气易氧化，降解。在加压试剂瓶中一周内性质稳定。

13.ThiofluorTM 为强亲核试剂，在密闭容器中保存。

14.不推荐用户自制OPA 稀释剂，因为硼酸钠（任何等级）包含着大量的重金属离子污染物和不溶物质。这些不纯物会沉淀在反应器和流通池中。由此造成的损坏不在保修范围之中。

预先混合的TRIONE的保存期限为3 个月，期间生成沉淀物的可能性增加。使用过期的TRIONE会导致柱后衍生系统堵塞。

15.随着放置时间的延长TRIONE对一级氨基酸的颜色强度增加20％。所以当更换TRIONE批号时会使灵敏度小幅度降低。

16.氧化了的TRIONE对一级氨基酸的颜色强度下降，但是不影响对二级氨基酸的强度。试剂在氧化的过程中变的越来越黄。

17.经常观察和记录压力，检查泄漏，及时发现问题。

18.除非背压调节器连接于检测器的废液管上，不要当洗提液的压力超过沸点时操作加热反应器。反应器内的沸腾会产生沉淀堵塞反应器，由此造成的损坏不在保修范围之中。

19.注意：在改变梯度、温度和其它操作条件之前，至少运行两次确认问题。改变之后，至少运行两次，出现相同结果后确认。特别是在优化梯度条件时。

20.一次只改变一个参数

21.至少运行两次，出现相同结果后再改变参数。所以至少进样三次，因为第一次进样往往不具有代表性。首先优化开始的梯度条件。

22.每个HPLC 模式的梯度条件均不同，本手册中推荐的程序为最常用的HPLC 泵程序。如果只需要色谱图的前端，可以省去后面的梯度程序，使用再生溶液直到碱性最强的精氨酸洗脱出来，然后用最初的缓冲溶液重新平衡。

23.分离效果对温度敏感，调整温度会改善分离。例如，当色谱柱温度降低时，苏氨酸和丝氨酸的分离度得到改善。但是温度略微升高时，酪氨酸和苯基丙氨酸分离度得到改善。

表面活性剂、染料、茚三酮和脂肪通常不能去除，只能防止。

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