生物传感器研究二十年的总结

山东省生物传感器重点实验室2007年10月29日 23:28 点击：2903

山东省生物传感器重点实验室冯德荣

　　一、前期研究历史
　　生物传感器研究和开发的目的是向社会提供采用生物传感器原理的新仪器和分析控制方法，它们可以广泛地应用于临床诊断和监护、食品分析、工业控制和环境状态的监测。
　　我们生物传感器的研究起步于1983年[1]。1986年山东省科委鉴定了第一项生物传感器成果："血糖速测仪的研制",它采用氧电极作生物反应中的换能器，以葡萄糖氧化酶为活性材料，用流动注射的方式实现分析流程(图1)。1988年我们又完成了维生素Ｃ传感器（氧电极型）的研究(图2)。虽然在实验室的条件下，以氧电极为换能器的生物传感器比较容易得到预期的研究结果，但是我们发现，传感器的稳定性很难控制，在应用中会经常碰到传感器输出信号的稳定性问题(如电化学传感器放置中信号的变化、氧电极测定中温度变化造成的溶解氧信号的变化)，使得构建成的测定系统转化成商品，由用户来实现测定十分困难。因此为数众多的我国生物传感器研究机构都面临着深入研究稳定的生物传感器，并把它们在实践中应用的困境。

图1、早期的血糖速测仪

图2、维生素C速测仪

　　我们在生物传感器实用化上取得突破性进展的标志是SBA-30型乳酸分析仪的开发成功(图3)[2]，它成为我国九十年代耐力竞技体育训练的主要科学仪器之一。追溯SBA-30型乳酸分析仪研究开发成功的经验，在整整八年的实验技术积累中，我们主要解决了以下四个技术难题：①研究了使生物材料能够制成薄膜的固定化技术，使酶膜既能长时期运行不用更换，还可以长期贮存和运送，这是生物传感器商品化的一项基础的前提；②研制了一种比氧电极更为稳定的换能器，即过氧化氢型电极，它可以在生物传感器测定条件下，高度稳定地保持的基础电流的输出；③解决了生物传感器信号处理的电子技术；④研制了一系列使生物传感器反应精确进行的分析装置配套条件。这些技术难题的解决，为生物传感器技术传播创造了良好的技术基础。

图3、我国第一种实用化的生物传感器---SBA-30型乳酸分析仪

　　二、九十年代的生物传感器研究
　　在基本解决上述技术难题的基础上，1992年我们完成了SBA-40型谷氨酸葡萄糖双功能生物传感分析仪的研制(图4) [3]。这是我们进入生物传感器自主创新研究开发的重要标志，我们的仪器设计包括了20多种智能化程序，其主程序满足了双电极系统的直接自动测定。谷氨酸传感器的研制成功并进入实用是国际首创，由于我国是世界上的味精大国，味精产量居世界第一，因此40型仪器的问世很快得到工厂用户的关注。它与葡萄糖、乳酸传感器一起成龙配套地监测控制发酵罐内的物质成分的变化（每年在我们向全国有关单位提供固定化酶膜共1500个，实现分析150万次/年），至今国际上还没有大规模应用生物传感器于工业测量实例的报道，它为味精行业提供了精确的生化成份检测和控制手段。由于工业生产是一种连续不可间断的生产过程，要求生物传感器产品能耐受各种温度变化、连续、电压波动等比较粗放的环境条件，SBA生物传感器几经改造，在技术上已经基本适应这一条件，经过7年多在几家大型味精企业集团使用的考验，已证明SBA-生物传感器能够连续不停地24小时长期运转。

图4、SBA-40型谷氨酸葡萄糖双功能分析仪

　　九十年代我们还进行了一系列的新型生物传感器的研究，同时不断地寻求生物传感器的各种服务对象。我们在拓展生物传感器的应用领域方面主要完成了以下几方面的工作：
　　1、研制了多酶协同作用的复合酶膜生物传感器。1993年研制成功的尿素生物传感器[4]，它的关键部件是3种酶复合而成的固定化酶膜圈，装配在过氧化氢电极上，可以测定血液或尿液中尿素的变化，目前已有近20家卫生防疫和体育训练单位的用户，可以用来检测人或动物运动后的疲劳程度。
　　2、用智能化计算机实现检测中生物反应的自动控制。微型计算机引入生物传感器的测定仪器装置大大改善了生物传感器的性能，实现了原先难于一步性直接得到结果的分析项目快速测定，例如糖化酶的测定[5]：经典的方法是繁琐的碘定量法。在生物传感器测定糖化酶的过程中，通过微机程序，可以让糖化酶测定底物在前20秒中预混合，并使葡萄糖电极对底物中产生干扰影响的葡萄糖反应基本完成，然后在1-2分钟内检测计量随后的由底物和酶反应中释放出的葡萄糖。用SBA生物传感分析仪(图5)测定糖化酶的活性比传统方法快了几十倍[5]。

图5、SBA-50型糖化酶生物传感分析仪

　　3、用双电极-差分的方法获得原先难于分析的生化样品测定。由于采用微机技术，许多原先不容易获得的分析测定项目，包括尿素、谷氨酰胺、淀粉、蔗糖、乳糖、麦芽糖等，都已能够通过双电极的差分方法由生物传感器自动分析来得到。方法的要点是：一个电极装配有谷氨酸、葡萄糖或乳酸酶膜，另一个电极装配有谷氨酸、葡萄糖或乳酸酶膜与要分析样品的分解酶的混合物。二个电极用标准物质同时标定，然后同时测定它们对底物的测定结果，得到目标物的差分定量分析结果。谷氨酰胺的分析就是这样的实例，它由谷氨酰胺酶和谷氨酸氧化酶二种酶的复合膜制成，可以得到谷氨酰胺和谷氨酸的混合信号，当由另一支谷氨酸氧化酶电极同时工作时，利用差分方法就可以同时得到谷氨酸和谷酰胺二种物质的精确的定量分析结果。谷酰胺、谷氨酸、L-乳酸和葡萄糖这四种成份是动物细胞生物工程中的主要物质控制要素，预计在今后产业化中会发挥重要的作用[6，7]。同样我们实现了尿素、转氨酶、淀粉、蔗糖、乳糖、麦芽糖等重要生化成份的生物传感器分析。
　　4、生物传感分析仪品种的更新换代。在九十年代中，我们的生物传感分析仪的品种不断更新，构成部件得到了进一步完善，使它们更加适合我国用户的需要。SBA生物传感器实现了系列化。从89年开始应用的SBA-30型分析仪，它的薄膜振动式搅拌器使用中不够可靠，智能化程度也不夠完善，到1995年被SBA-50型单电极生物传感分析仪所替代。SBA-40型双电极生物传感分析仪先后有A、B、C三种更新换代产品。
　　5、建立相关的国家标准。生物传感器应用标准的制订也是生物传感器研究开发和应用中的重要工作，经我们起草和专家评审，1996年国家技术局发布了食品中葡萄糖的测定方法-酶电极法国家标准(GB/T 16285-1996)，为生物传感器的广泛应用提供了标准化的平台。

　　三、生物传感器研究开发的新进展
　　进入新世纪以来，我们不断地进取，在生物传感分析仪的医用、自动、精密分析上做文章，在生物传感器领域又获得几项新的研究成果。
　　1、研制生物传感在线分析系统。生物传感器作为生物技术的关键技术之一，处在生物技术发展的瓶颈部位而受到我国科研主管领导机关的重视。在国家"九五"生物技术攻关课题中，提出了工业控制检测上的生物传感器在线检测系统的研制任务，以期望能在未来生物技术普遍需要的发酵罐和生化反应器中实现这种新的控制方式[12-14]。预计对传统的发酵工业和生物技术产业将产生深远的影响。
　　我们在2000年的按期对 "SBA-60型生物传感在线分析系统的研制"项目进行了鉴定(图6)。

图6、SBA-60型生物传感在线分析系统

　　60型分析仪是一种以生物传感器为关键器件的大型仪器设备，它采用自动化的机械臂实现自动取样、稀释等操作，用生物传感器实现生物反应器样品的自动检测，它集发酵罐常规控制和物料控制于一体，具有其它系统无法比拟的优点：由生物传感器检测相应的生化物质及其变化，还能测定反映菌体的生长情况光密度和温度、pH、搅拌、消泡电阻等常规发酵指标。系统可与计算机相连接，自动记录发酵过程中各项指标的变化过程，在计算机平台上完成关键参数的发酵过程直观图像，供技术人员分析各因素对发酵过程的影响，探索最佳发酵条件。也可脱离计算机独立工作，发现发酵异常时，可随时与计算机联机，取出保存数据进行分析研究。系统用于提升发酵和其它生物技术行业的生产模拟研究活动及生产过程监控，改变目前人工采样的状况，逐步过渡到自动控制，将对传统生物技术的改造发挥重要的作用。
　　2、研制医用的生物传感自动分析仪。2003年鉴定的SBA-70型血糖乳酸自动分析仪是另一种创新仪器，它主要以医院的急症室、社区诊所中使用的临床快速、实时检测为目的，填补传统血糖测定几种方式的空白。它还能够同时完成医院化验空白的血乳酸的测定。该仪器的研制填补了国内空白，其主要技术指标，采血20微升，分析速度每分钟一个样品，精确度指标定标时不大于1。5％，测定结果CV<2％，酶膜寿命葡萄糖膜大于30天，乳酸膜大于15天，可自动进样，并与计算机相联等达到或超过国外同类仪器的指标。该项研究成果属国内首创，达到了国际先进水平。

图7、SBA-70型生物传感在线分析系统

　　3、研究细胞活性的生物传感器测定。研究利用微生物活细胞在生长过程中优先以葡萄糖作为基本能源和碳源这一特点，通过测定一定生长时间内发酵液样品对葡萄糖的利用数量，推测当前微生物发酵液中微生物菌体的数量。本项研究利用固定化酶生物传感器技术来测定葡萄糖浓度，具有测定速度快、精度高的特点，并把固定化葡萄糖生物传感器测定系统，微型恒温发酵培养系统，自动采样灭活系统集成于一体，研制成SBA-XJ1微生物活细胞数快速检测仪，该仪器可广泛用于于酿酒、谷氨酸、抗生素等需要对微生物菌体进行计数的发酵和生物技术行业。

　　我们的生物传感器研究、开发是一个长期的技术积累的过程，20多年来研制了新型的生物传感器有20种(表1)，有三种是国家级重点新产品，共获得省部级科技进步奖三项，国家发明三等奖一项，并拥有体育、轻工、医疗、食品、科研院校的技术服务对象几百家。

表1、开发的SBA-系列生物传感器

编号	课题名称	课题来源	完成日期/年	备考及文献
1	葡萄糖传感器(氧电极型)	山东省科委	1986	初步应用
2	维生素C传感器(氧电极型)	省科学院	1988	初步应用
3	固定化乳酸酶膜及其试剂盒	国家体委	1989	普及应用
4	SBA-30型乳酸分析仪	省科学院	1989	普及应用
5	测定鱼虾鲜度的生物传感器	国家自然科学基金	1992	初步应用
6	SBA-40型谷氨酸葡萄糖分析仪	山东省科委	1992	普及应用
7	SBA-40型尿素氮葡萄糖分析仪	山东省科委	1993	初步应用,论文发表在"生物工程学报
8	测定转氨酶的生物传感器	山东省科委	1993	已应用
9	食品中葡萄糖分析标准	国家技术监督局	1995	已实施
10	SBA-40型酒度糖度分析仪	山东省科委	1995	初步应用
11	胆碱传感器	山东省科委	1995	初步应用，论文发表在"生物工程学报"
12	SBA-60型四指标生物传感分析系统	山东省科委	1995	作为国家"九五"攻关前期研究
13	糖化酶活力快速测定仪	山东省科委	1995	初步应用
14	SBA-50型葡萄糖生物传感分析仪测定麦芽糖的研究		1998	论文发表在"山东科学"
15	谷酰胺及谷氨酸分析仪	山东省科技厅	2000	初步应用
16	用生物传感器测定蔗糖	国家科技部	1999	中日酶工程研讨会论文
17	生物传感器及相关系统		2000	初步应用
18	SBA-60型生物传感在线分析系统	国家科技部	2000	已应用
19	SBA-70型生物传感在线分析系统	山东省科技厅	2003	已应用
20	测定活细胞活性的生物传感器	山东省科技厅	2003	初步应用

四、今后的方向
　　山东省应用开发生物传感器具有得天独厚的优势，居于全国领先地位：实验室在政府支持下已正式命名为山东省生物传感器重点实验室，是国内独家具有向社会提供可应用的精密分析类型的生物传感器和配套试剂的研究单位。
　　目前我们生物传感器发展中的主要问题是：因作为新技术的生物传感器宣传程度不够，应用规模面局限于工厂中间分析和科学研究单位、防疫站等，数量比较少。还没有进入医院。目前生物传感器处于实验室研究开发阶段，以研究为主，同时进行小批量的生物传感器供应，尚处在产业化前期；比较具有市场潜力的医用生物传感器和自动化程度更高的生物传感器精密仪器的商业化开发需要进行市场化的运作。
　　一项边缘学科在发展过程中，如果长期不能获得应用方面的进展，就有可能被边缘化，
发展对策和措施：
　　生物传感器是极具有发展潜力的学科领域，作为知识经济的新增长点，它将促进生物技术产业和常规生物产业的发展，可以为许多经济领域的过程中提供控制上的不可缺少的信息、新的快速分析方法、新的生物仪器设备的来源。为此我们需要做好以下工作：
　　1. 加强山东省生物传感器重点实验室的建设，逐渐创造条件，把这一有特色的研究实验室发展成为全国最具实力的研究开发中心。
　　2. 创造商业开发生物传感器的机会。除继续拓展应用领域外，主要重点放在医用生物传感器开发上。
　　面临21世纪生物经济发展的挑战，生物技术、信息、海洋产业，将得到优先发展。处于这些产业交叉点上的生物传感器技术，在未来技术发展中也必将获得突破性进展。

　　　　　　　　　　　　　　　　　　参考文献
1. Feng Derong, Biosensors and their application in the People‘s Republic of China , In "ADVENCES INBIOSENSORS, VOLUME 4",289-313, 1999,JAI PRESS INC.
2. 冯德荣，周万里等，固定化乳酸酶膜圈的研究山东科学1990，3（3）p1-6
3. 冯德荣，尚雪芹等，适用于发酵生产过程的SBA-40 L谷氨酸-葡萄糖双功能分析仪的研制，食品与发酵工业1993， 4：33-37
4. 冯德荣 ,李智红等，尿素氮-葡萄糖双功能分析仪的研究生物工程学报. 1996，12(2)： 189-193
5. 史建国，周凤臻，冯德荣等，酶电极法测定葡萄糖淀粉酶活性研究，生物工程学报，1996，12增刊，226-231
6. 冯德荣，生物传感器分析技术及其在工业、农业、医学、商检、环保中的应用（1998，厦门）关于生物产业发展中热点问题研讨会，专题报告。
7. 林福玉，陈昭烈等，大规模动物细胞培养生物技术通报1999，1，p32-35
8. 冯德荣，孙士青等，测定转氨酶生物传感器研究山东科学1995，8(1)：p45-49
9. 冯德荣，宋家华，食品中葡萄糖的测定方法-酶电极法国家标准GB/T 16285-1996，国家技术局发布
10. 冯德荣，孙士青等，测定胆碱的生物传感器生物工程学报1997，13(2), p190-194
11. 冯德荣，周万里等，SBA-60型四指标生物传感分析系统山东科学1998，11（2），p32-36
12. 冯德荣，高强等，谷氨酸发酵中乳酸值变化规律的研究中国食品发酵工程研究会十周年纪念论文集，p76-79, 1998.8.18杭州
13. 冯德荣，生物传感器研究应用现状生物工程进展 1996，16(3)：p13-15

（来源：山东省生物传感器重点实验室）

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