大片段PCR的注意点

大片段PCR的注意点

在实验室使用PCR仪进行PCR时，遇到3-5kb以上的大片段DNA时，许多同学的扩增结果往往出现假阴性，条带模糊等不理想的情况。那么对于大片段的DNA进行PCR时要注意哪些？怎样才能得到理想的结果呢？

主要从以下方面入手更正：

1,确定反应体系各组分的量是否足够（如引物量、模板量，镁离子量等）；

2,确定延伸时间是否足够，计算适当增加延伸时间（延伸时间要足够长，一般按1min/kb延伸。）；

3,确定退火温度是否合适，适当降低退火温度；

4,确定所使用的酶是否合适，可试试Takara的LA Taq等；

5,适当提高反应体系的pH值，反应初始pH应控制在pH8.8-9.2范围内；

6,尽量缩短升温、降温过程，尽可能选择导热性优良的薄壁反应管；

其中对于酶的选择较为关键:对于大于4kb的PCR，建议使用长片段PCRTaq(如TAKARA公司的LA-Taq，MBI公司的long PCR Enzyme Mix等)。引物是则是另一个重要的因素：引物长度最好在20~25bp之间，Tm在60度左右，可Primer premier5.0等软件设计，两条引物Tm不应相差超过4摄氏度。