两栖类骨髓细胞染色体制作方法实验

一、实验目的
了解和掌握动物染色体涂片标本的制作过程，为今后开展有关这方面的科研打下基础。

二、实验原理　　
请参阅实验十《小白鼠染色体的制备与观察》

三、实验材料　　
青蛙或蟾蜍

四、实验器具和药品试剂
冰箱、离心机、恒温水浴锅、显微镜、分析天平、药物天平、台称、试管架、离心管、吸管、烧杯、量筒、注射器(1ml、5ml)、5号针头、载玻片、解剖盘、解剖刀、剪刀、镊子、酒精灯、切片盒、切片架、纱布、黑白胶卷。 0.1％秋水仙素溶液、0.046M KCL 溶液、1％柠檬酸钠溶液、甲醇、冰醋酸、磷酸缓冲液、Giemsa原液、冲洗底片的药液。

五、实验方法和步骤
(一) 前处理
用台称称量青蛙或蟾蜍的体重，然后按10微克／克动物体重的剂量,腹腔注射秋水仙素。
(二) 取材
注射4小时后，将动物处死，用剪刀剪开皮肤和肌肉，取出大腿骨和胫骨，剔净股骨上的肌肉，然后用一小块纱布来回搓干净。剪开两端股骨，用注射器（内装5ml 1％ 柠檬酸钠溶液）缓慢冲洗骨髓细胞到离心管中，经平衡后离心8分钟，速度为1000转／分钟。
(三) 低渗
吸去上清液，留沉淀物0.2ml，加0.046M KCL 溶液至8 ml 刻度，用吸管冲匀沉淀物，在恒温水浴(28℃)处理20分钟或更长一点时间。
(四) 固定
低渗后，以每分钟1000转速度离心10分钟。用吸管小心吸去上清液，留0.2ml沉淀物，冲散后沿管壁慢慢加入6ml固定液。 冲匀后静止固定20分钟。重复固定1～2次，离心的速度与时间以上述相同。
(五) 滴片
吸去上清液，留0.2ml沉淀物，加4滴新配的固定液，冲匀沉淀物。从冰箱取出预先冷冻的载片，每片滴3滴细胞悬液，立即用嘴向载片上吹气，使细胞均匀分散，在酒精灯火焰上来回烤一下，以助染色体更好分散和展开。
(六) 染色
用10：1 Giemsa染液染色20分钟(Giemsa原液用PH＝6.8磷酸缓冲液稀释)，然后用水冲洗，片干后镜检。
(七) 镜检
在中倍镜下找染色体分散好的中期分裂相，转至高倍镜详细观察两栖类染色体的数目，属于大、中、小染色体各有多少条。