高效液相色谱法检测黄曲霉毒素M1操作规程

　　针对近期奶中出现的黄曲霉毒素M1超标问题，广州深华生物公司提出以下快速解决方案。

　　1. 仪器

　　1.1 高效液相色谱仪配荧光检测器

　　1.2 震荡器(或高速搅拌器)

　　1.3 高速离心机

　　2. 试剂与试液

　　2.1 色谱甲醇

　　2.2 蒸馏水

　　2.3 乙腈+水(25+75)

　　2.4 石油醚

　　2.5 10%乙腈

　　2.6 氢氧化钠溶液(0.5mol/L)

　　玻璃纤维滤纸(PriboFast免疫亲和柱免费赠送)

　　3. 测定法

　　本法系用高效液相色谱法(GB/T 18980-2003)测定牛奶，奶粉等产品中的黄曲霉毒素M1，除另有规定外，按下列方法测定。

　　3.1色谱条件

　　色谱柱：C18柱，150×4.6mm，5um

　　检测器：荧光检测器;激发波长365nm，发射波长435nm;

　　流动相：乙腈-水(25：75)

　　流 速：1.0ml/min

　　进样量：20ul

　　柱 温：室温

　　3.2 标准品溶液的配制

　　取黄曲霉毒素M1标准品，用乙腈稀释成0.5ug/ml的标准储备液。根据使用需要，准确吸取10μl、20μl、50μl、100μl、200μl的黄曲霉毒素标准储备液，置5ml的容量瓶中，用流动相稀释至刻度，配成相当于1ng/ml、2g/ml、5ng/ml、10g/ml、20ng/ml的标准工作液，即得。

　　3.3 样品前处理

　　3.3.1牛奶

　　将100mL牛奶水浴加热至40℃;

　　4000r/min离心15min，收集50mL清澈液待用;

　　3.3.2乳粉和粉状婴幼儿配方食品

　　称取10g奶粉样品，将100mL50℃水多次少量加入，搅拌，使奶粉充分溶解;

　　6000r/min离心15min，收集50mL清澈液待用;

　　3.3.3发酵乳(包括固体状、半固体状和带果肉型)

　　称取60 g混匀的试样，用0.5mol/L 的氢氧化钠溶液在酸度计指示下调pH至7.4;

　　用高速均质器在 9500 转/分钟，高速匀浆5 min

　　水浴加热至40℃;

　　4000r/min离心15min，收集50mL清澈液待用

　　3.3.4干酪

　　称取经切细、过10目圆孔筛混匀的试样5g置于50mL离心管中，加2 mL水和30 mL甲醇;

　　用高速均质器在 9500r/分钟，高速匀浆5 min;

　　超声提取30 min;

　　在6000r/分钟下离心15 min，收集上清液并移入250 mL分液漏斗中。

　　在分液漏斗中加入30 mL石油醚，振摇2 min;

　　待分层后，将下层移于50 mL烧杯中，弃去石油醚层。

　　重复用石油醚提取2次;。

　　将下层溶液移到100 mL圆底烧瓶中，减压浓缩至约2 mL;

　　浓缩液倒入离心管中，烧瓶用乙腈-水溶液(1+4) 5 mL分2次洗涤，洗涤液一并倒入50 mL离心管中;

　　加水稀释至约50 mL，在6000 转/分钟下离心 5 min，上清液供净化处理。

　　3.3.5奶油

　　称取5g试样，置于50 mL烧杯中;

　　用20 mL石油醚将其溶解并移于250mL具塞锥形瓶中。

　　加20 mL水和30 mL甲醇，振荡30 min后，将全部液体移于分液漏斗中;

　　待分层后，将下层溶液全部移到100 mL圆底烧瓶中，在旋转蒸发仪中减压浓缩至约5 mL，加水稀释至约50mL，供净化处理。

　　3.4 供试品溶液的制备

　　3.4.1 PriboFast® 黄曲霉毒素M1免疫亲和柱的操作

　　将免疫亲和柱连接于50.0mL玻璃注射器下。准确移取50.0mL净化溶液注入玻璃注射器;

　　将空气压力泵与注射器连接，调节压力使溶液以约2-3mL/min流速缓慢通过免疫亲和柱，直至2～3mL空气通过柱体;

　　更换10ml注射器与亲和柱连接，在注射器中加入10ml水，调节压力使水以约6mL/min流速清洗亲和柱。

　　准确加入4mL色谱级乙腈洗脱，流速为1 mL/min～2mL/min，收集全部洗脱液于玻璃试管中，供检测用。(建议将乙腈的量分2-4次加入。每次加入后，要让甲醇充分浸泡柱子里的凝胶2分钟。洗脱后的乙腈溶液，最好是水浴30℃加热吹近干。用10%乙腈定容后上液相)

　　3.5 测定

　　精密量取1ng/ml、2g/ml、5ng/ml、10g/ml、20ng/ml的标准工作液各20ul，注入液相色谱仪，测定峰面积，以峰面积为纵坐标，浓度为横坐标，绘制标准曲线。另精密量取供试品溶液20ul，注入液相色谱仪，测定峰面积，从标准曲线上读出供试品中相当于黄曲霉毒素M1的量，计算，即得。

　　1.本实验应有相应的安全、防护措施，并不得污染环境。

　　2.残留有黄曲霉毒素M1的废液或废渣的玻璃器皿，应置于专用贮存容器(装有10%氯酸钠溶液)内，浸泡24小时以上，再用清水将玻璃器皿冲洗干净。