基因芯片介绍

基因芯片相关技术

生物芯片是将生命科学研究中所涉及的不连续的分析过程(如样品制备、化学反应和分析检测)，利用微电子、微机械、化学、物理技术、计算机技术在固体芯片表面构建的微流体分析单元和系统，使之连续化、集成化、微型化。

生物芯片技术主要包括四个基本要点：芯片方阵的构建、样品的制备、生物分子反应和信号的检测。1、芯片制备，先将玻璃片或硅片进行表面处理，然后使DNA片段或蛋白质分子按顺序排列在片芯上。2、样品制备，生物样品往往是非常复杂的生物分子混合体，除少数特殊样品外，一般不能直接与芯片反应。可将样品进行生物处理，获取其中的蛋白质或DNA、RNA，并且加以标记，以提高检测的灵敏度。3、生物分子反应，芯片上的生物分子之间的反应是芯片检测的关键一步。通过选择合适的反应条件使生物分子间反应处于最佳状况中，减少生物分子之间的错配比率。4、芯片信号检测，常用的芯片信号检测方法是将芯片置入芯片扫描仪中，通过扫描以获得有关生物信息。

一、芯片制备：

基因芯片的制备主要有两种基本方法，一是在片合成法，另一种方法是点样法。在片合成法是基于组合化学的合成原理,它通过一组定位模板来决定基片表面上不同化学单体的偶联位点和次序。在片合成法制备DNA芯片的关键是高空间分辨率的模板定位技术和固相合成化学技术的精巧结合。目前，已有多种模板技术用于基因芯片的在片合成,如光去保护并行合成法、光刻胶保护合成法、微流体模板固相合成技术、分子印章多次压印原位合成的方法、喷印合成法。在片合成法可以发挥微细加工技术的优势，很适合制作大规模DNA探针阵列芯片，实现高密度芯片的标准化和规模化生产。美国Affymetrix公司制备的基因芯片产品在1.28*1.28cm²表面上可包含300,000个20至25mer寡核苷酸探针，每个探针单元的大小为10um X 10um。其实验室芯片的阵列数已超过到1,000,000个探针。 

图11-5-3 基因芯片在片合成原理图

基因芯片点样法首先按常规方法制备cDNA（或寡核苷酸）探针库，然后通过特殊的针头和微喷头, 分别把不同的探针溶液，逐点分配在玻璃、尼龙或者其它固相基底表面上不同位点,并通过物理和化学的结合使探针被固定于芯片的相应位点。这种方式较灵活，探针片段可来自多个途径，除了可使用寡聚核苷酸探针，也可使用较长的基因片段以及核酸类似物探针（如PNA等）。探针制备方法可以用常规DNA探针合成方法、或PCR扩增的cDNA、EST文库等。固定的方式也多种多样。点样法的优越性在于可以充分利用原有的合成寡核苷酸的方法和仪器或cDNA探针库，探针的长度可以任意选择，且固定方法也比较成熟，灵活性大适合于研究单位根据需要自行制备科研型基因芯片，制作点阵规模较小的商品基因芯片。 

二、靶基因样品的制备
    与普通分子生物学实验一样，靶基因的制备需要运用常规手段从细胞和组织中提取模板分子，进行模板的扩增和标记。基因芯片包括大量探针分子，因此，靶基因样品的制备方法将根据基因芯片的类型和所研究的对象(如mRNA 、DNA等)而决定。对于大多数基因来说，mRNA 的表达水平大致与其蛋白质的水平相对应，因此，对细胞内mRNA 表达水平进行定量检测对于了解细胞的性质与状态十分重要。用基因芯片可以对细胞内大量基因的mRNA表达差异进行检测，其靶基因的制备一般采用RT-PCR方法以寡聚dT作引物进行扩增。

待测样品的标记，主要采用荧光分子。常规标记的过程是通过在扩增过程中加入含有荧光标记的dNTP（至少一种为荧光标记的），荧光标记的单核苷酸分子，在转录和复制过程中，被引入新合成的DNA片段。后者变性后，即可与基因芯片上的微探针阵列进行分子杂交。也可采用末端标记法，直接在引物上标记荧光。即在引物合成时通过应用荧光标记的dNTP制备荧光标记引物，或通过标记生物素，进行荧光标记。

对于阵列密度较小的基因芯片(经常用膜片作为基底)可以用同位素检测法，采用³²P标记技术，这样可以运用现在普通使用的同位素显影技术和仪器。但是，在使用同位素靶基因标记法过程中，一些表达量高杂交信号强的点阵，容易在其周围产生光晕，当其周围点阵的杂交信号较弱时，其杂交信号容易受到强杂交信号的掩盖。 

三、靶基因的杂交及其信号的检测
    cDNA基因芯片与靶基因的杂交过程与一般常规的分子杂交过程基本相同。在基因芯片的杂交检测中，为了更好的比较不同来源样品的基因表达差异，或者为了提高基因芯片检测的准确性和测量范围，通常使用多色荧光技术。即把不同来源的靶基因用不同激发波长的的荧光探针来修饰，并同时使它们与基因芯片杂交。通过比较芯片上不同波长荧光的分布图，可以直接获得不同样品中基因表达的差异。

人们还发展了其它灵敏度高、特异性好的基因芯片杂交检测方法。例如短序列偶联法。该方法首先将非标记的DNA靶序列与基因芯片上探针阵列进行完全杂交，若基因芯片上探针的固定端是5’端时，继续以靶基因为模板，可以在暴露于溶液中的3’-OH上用DNA聚合酶合成上新的带有荧光标记的碱基（ddNTPs）。通过检测ddNTP可以分辨出靶序列的基因。 

美国Nanogen公司提出了一种通过交变电场加速基因芯片的杂交速度的主动式基因芯片。他们利用核酸分子所带的负电性质，通过快速反转电场的极性，使靶基因与探针间产生快速结合和分离。通过控制电场的大小，使得完全匹配杂交的核酸分子保留在阵列表面，而非特异性结合的DNA在电场的作用下与探针分离。这种芯片的分子杂交速度可缩短至1分钟以下甚至数秒（cheng et al，1998），因此有较广阔的应用前景。

四、基因芯片相关的生物信息学

图11-5-4 基因芯片设计及信息处理

基因芯片原理

基因芯片(gene chip)的原型是80年代中期提出的。基因芯片的测序原理是杂交测序方法，即通过与一组已知序列的核酸探针杂交进行核酸序列测定的方法，可以用图11-5-1来说明。在一块基片表面固定了序列已知的八核苷酸的探针。当溶液中带有荧光标记的核酸序列TATGCAATCTAG，与基因芯片上对应位置的核酸探针产生互补匹配时，通过确定荧光强度最强的探针位置，获得一组序列完全互补的探针序列。据此可重组出靶核酸的序列。

图11-5-1 基因芯片的测序原理图

基因芯片又称为DNA微阵列(DNA microarray)，可分为三种主要类型：1）固定在聚合物基片（尼龙膜，硝酸纤维膜等）表面上的核酸探针或cDNA片段，通常用同位素标记的靶基因与其杂交，通过放射显影技术进行检测。这种方法的优点是所需检测设备与目前分子生物学所用的放射显影技术相一致,相对比较成熟。但芯片上探针密度不高，样品和试剂的需求量大，定量检测存在较多问题。2）用点样法固定在玻璃板上的DNA探针阵列，通过与荧光标记的靶基因杂交进行检测。这种方法点阵密度可有较大的提高，各个探针在表面上的结合量也比较一致，但在标准化和批量化生产方面仍有不易克服的困难。3）在玻璃等硬质表面上直接合成的寡核苷酸探针阵列,与荧光标记的靶基因杂交进行检测。该方法把微电子光刻技术与DNA化学合成技术相结合，可以使基因芯片的探针密度大大提高，减少试剂的用量，实现标准化和批量化大规模生产，有着十分重要的发展潜力。

图11-5-2 基因芯片原型

它是在基因探针的基础上研制出的，所谓基因探针只是一段人工合成的碱基序列，在探针上连接一些可检测的物质，根据碱基互补的原理，利用基因探针到基因混合物中识别特定基因。它将大量探针分子固定于支持物上，然后与标记的样品进行杂交，通过检测杂交信号的强度及分布来进行分析。基因芯片通过应用平面微细加工技术和超分子自组装技术，把大量分子检测单元集成在一个微小的固体基片表面，可同时对大量的核酸和蛋白质等生物分子实现高效、快速、低成本的检测和分析。

由于尚未形成主流技术，生物芯片的形式非常多，以基质材料分，有尼龙膜、玻璃片、塑料、硅胶晶片、微型磁珠等；以所检测的生物信号种类分，有核酸、蛋白质、生物组织碎片甚至完整的活细胞；按工作原理分类，有杂交型、合成型、连接型、亲和识别型等。由于生物芯片概念是随着人类基因组的发展一起建立起来的，所以至今为止生物信号平行分析最成功的形式是以一种尼龙膜为基质的“cDNA阵列”，用于检测生物样品中基因表达谱的改变。