感受态细胞的制备

1、 受体菌的培养

从平板上挑取新的活化后的E.coli TG1单菌落，接种于5ml  LB液体培养基中，37℃下振荡培养12小时左右，取50ul培养液转入5ml LB中，37℃振荡培养1~1．5小时至对数生长期OD600=0．5左右。

2、 感受态细胞的制备

⑴、将培养液1．5ml转入离心管中，冰上放置20分钟。

⑵、置于4℃，5000rpm离心5分钟，倒尽上清。

⑶、添加一半菌液体积（750ul）预冷的50mM的CaCl₂，用枪轻轻吹打，使细胞悬浮，

冰上放置30分钟。

⑷、4℃,5000rpm离心5分钟，弃上清。

⑸、再加入200ul预冷的50mM的CaCl₂溶液，轻轻悬浮细胞，冰上放置备用。

新鲜的感受态细胞在4~24小时之内可直接用于转化，也可加入总体积15%的无菌甘油，

混匀后置于-70℃可保存6个月，转化效率基本不变。

3、转化

   ⑴、取200ul摇匀后的感受态细胞悬液，加入质粒4ul，用枪轻轻吹打均匀，冰浴30分钟。

   ⑵、42℃,保温90秒钟后，迅速放入冰中，冰浴5min。

   ⑶、加入37℃预热的1ml的LB液体培养基，混匀。37℃培养1小时，使细胞恢复正常生长状态。

   ⑷、3000rpm离心10分钟。

   ⑸、弃去1ml上清，余下的200ul用枪轻轻吹打均匀，使细菌充分悬浮后均匀涂布于含Amp的筛选平板上。

⑹、37℃正面向上放置半小时后，倒置培养8~12小时。

对照1、以同体积的无菌双蒸水代替DNA溶液，其它操作与转化组相同。

对照2、以同体积的50mM的CaCl₂溶液代替感受态细胞悬液，其它操作与转化组相同。