微型全化学分析芯片分析毒性重金属离子（3）

3  微芯片的制作及效能测试
3.1引言
微型全化学分析系统(mTAS)中微芯片是关键部分，其制作方法、材料的选取都是整个体系的核心。早期用于制作化学微芯片的材料主要是硅、玻璃、石英等材料[75,76,77]。玻璃、石英是优良的制作化学微芯片的材料，透光性好，抗溶剂能力强，应用的范围极为广泛。但是这两种材料的微加工方法复杂，制作成本昂贵，不易在普通实验室制作。同时这两种材料所制作的芯片键合温度要求高、操作不便、键合成功率较低。硅在微细加工领域的应用十分广泛，其刻蚀技术较为成熟，但是硅有透光性差、抗溶剂溶解能力低下等缺点，因此并不是一种理想的制作化学微芯片的材料。20世纪90年代中后期，研究者逐渐把制作化学微芯片的材料转移到有机聚合物上[15,69,77]。有机聚合物如聚二甲基硅氧烷(PDMS)等具有透光性好、弹性好、制片工序简单、底片和盖片键合温度低、成本低等优点，适合普通实验室制作。有机聚合物的制片技术，一般采用压印(Imprinting)和印刻(Embossing)法，注塑成模法以及激光烧蚀等[77]。
本节研究了有机玻璃(PMMA)及聚二甲基硅氧烷(PDMS)制作化学微芯片的过程及条件，利用显微成像系统观察了制作的有机聚合物芯片管道的形状及深宽，对比了有机聚合物芯片和化学腐蚀法刻蚀的玻璃芯片的管道表面粗糙度。以制作出的有机玻璃微芯片为对象，从实验上观测了两液流在微管道中的混合状况。在有机玻璃(PMMA)芯片上制作了直管道和折叠管道的二维管道结构，采用化学发光检测对标准Pb2+和Co2+样品进行了分析测试；同时还制作了二层三维结构的微芯片，流体更易于在空间变向的三维管道中混合，提高了流体的混合效率、样品和试剂的反应效率；以光电倍增管(PMT)检测了在不同压力下管道中试剂和样品反应得到的光信号，定性说明流体驱动压力变化带来的流体混合程度的变化，以及弯曲折叠变向管道促进样品、试剂的混合效率。在芯片上以Luminol-H2O2-Co2+化学发光体系对Co2+标准样品以及Luminol-KMnO4-Pb2+化学发光体系对Pb2+标准样品进行了测定，对芯片的可靠性进行了评价。
3.2 实验部分
3.2.1实验材料与试剂
聚二甲基硅氧烷(PDMS，化学试剂，美国道康宁公司)；有机玻璃(四川彭州市庆兴有机玻璃厂)，尺寸为30×40×4 mm，边缘机械抛光、然后水洗、乙醇洗，再用蒸馏水浸泡在密闭的容器中待用；直径200 mm的铜丝。Pb2+标准溶液(1.0×10-3 mol/L)；Co2+标准溶液(10 mg/mL)；鲁米诺(Luminol)储备液(1.0×10－2 mol/L)；H2O2(33％)；KMnO4(1.0×10-3 mol/L)。所用试剂为分析纯，水为重蒸水，标准溶液使用时逐级稀释。
铜丝模型：按所设计的微管道布局及反应体系，把铜丝制作成所需微管道的布局，在150℃下加热铜丝，用两平整金属片和玻璃片在2.0 MPa压力下压住铜丝并保持30 min。
玻璃负片：使用标准光刻、化学腐蚀法刻制，长宽为30×40 mm，管道深宽150×150 mm(中国信息产业部重庆南坪26所制作)。
3.2.2玻璃芯片的制作
实验用标准光刻、湿法化学刻蚀技术刻蚀了玻璃正片和玻璃负片，图3.1为刻蚀玻璃正片的工艺过程。在特种玻璃片上镀上100 nm左右厚度的铬膜，然后
图3.1 玻璃芯片的刻蚀工艺过程
Fig 3.1.  Procedure of photolithographic fabrication of glass
在铬膜表面覆盖一层光刻胶。将计算机CAD软件包制作的芯片图放于光刻胶上方，通过曝光显影，然后用铬腐蚀液刻蚀铬膜层，再用玻璃腐蚀液刻蚀玻璃层。玻璃负片的制作和制作玻璃正片的过程相同，只是这里制作的是凸起的槽道，而不是凹槽。
3.2.3有机玻璃化学芯片的制作
1)有机玻璃微芯片结构设计
有机玻璃微芯片的结构如图3.2所示，a为两混合载流的二维变向微管道布局芯片，A、B为载流和试剂通道，S1、S2为进样口，E为废液出口。A、B两载流通道长为6 mm，进样口S1离A、B垂直距离为18 mm。整个混合管路的长度为200mm。分别采用金属丝压印和玻璃负片印刻方法制作了两种有机玻璃微芯片。A、B、S1、S2、E点对应的盖片上打有孔，直径为2 mm。图b为三维空间变向有机玻璃两层微芯片。
         
              a                               b
图3.2 有机玻璃化学芯片结构示意图(a：单层二维结构；b：三维空间变向结构)
Fig.3.2 The scheme of microfluidic chemical PMMA chip.(a:2 D structure  b: 3 D structure)
2)底片制作 
准备50×60 mm的两平整玻璃片，使用乙醇清洗干净，在一块玻璃片上放上制作的金属丝模型(或玻璃负片)，再在其上放上一块清洗好备用的有机玻璃片，然后放上另一块清洗干净的玻璃片，放入内部清洁干净的恒温烘箱中并加上1.5MPa的压力，在170～180℃烘箱中保持10 min后取出，底片上的微管道即制成。由于玻璃微管道的凸起部分易脆，所以在加压过程中，压力应该维持在500～1.0 MPa之间，温度保持20 min左右。
3)盖片制作 
在已制作好的底片上放上另一块同样大小的有机玻璃片，根据样品、载流、试剂、废液的进出口，在盖片上进行标记。然后使用直径2 mm的铁金属丝在电炉上加热至红热，对准上述标记的进出口处进行瞬间烧蚀，烧蚀过程中应快速，而且铁金属丝应在温度未大幅下降的情况下取出。
4)底片和盖片的键合 
按上述方法制作好的有机玻璃底片和盖片用乙醇清洗、蒸馏水浸泡，风干后，使用脱脂棉沾取四氢呋喃在盖片上涂覆少许，立即把底片与盖片合上，在平整的玻璃片或金属片夹板上加1.5 MPa压力,放入120℃烘箱中保持15 min冷却取出即可。
3.2.4 PDMS化学芯片的制作
    用蒸馏水、乙醇分别清洗玻璃负片、盛放PDMS的玻璃容器槽。称取PDMS预聚物与固化剂按10:1的质量比混合，倒入放有凸槽玻璃芯片的光滑平整的5×5cm的玻璃容器中，再把整个平整放入真空干燥器中进行抽气，直到混合物中夹杂的气泡被抽完为止，约40 min，然后将其移入烘箱中95℃烘烤1 h左右即可。在烘箱中烘干固化后，玻璃芯片上的管道图形就转移到了PDMS上，将PDMS从玻璃芯片上剥离下来，切除边缘部分，就可以得到PDMS芯片的底片。PDMS的盖片制作，由于进样，载流进入，废液流出都是从盖片上进行的，因此盖片的制作，只需要在相应的地方制作出液流进出的孔。方法是在相应的地方放置大小合适的圆柱形金属丝即可。
3.2.5 有机玻璃微芯片上微管道及液流混合的观测
以显微成像技术观测了本方法制作的PMMA微芯片和化学腐蚀法制作的玻璃芯片。芯片在显微镜下分别使用了相互反应的两有色液流(高锰酸钾和亚甲基兰)和无反应性的两颜色液流(罗丹明B和荧光黄)进行了液流混合状态的观测。同时以KMnO4和Luminol，H2O2和Luminol作为二载流进行混合反应，以光电倍增管(PMT)作为发光信号检测器，改变压力考察了流体的混合效率。实验时，用密封胶封住进样口，芯片放在显微镜载物台上。使用光电倍增管检测时，芯片放在光电倍增管光窗上。A、B通入两载流，使用柱塞泵改变压力驱动两载流。
3.2.6有机玻璃微芯片分析系统的组装
以本方法制作的微芯片对Luminol-KMnO4-Pb2+体系进行了分析测试。系统组装的芯片为图3.2a，A为KMnO4溶液流路，B为Luminol流路，A、B由柱塞泵驱动。Pb2+样品由蠕动泵经S1注入，注入样品时可采用定时进样或定容进样，定时进样时，用密封胶封住S2，蠕动泵在S1的一边，调节蠕动泵的蠕动时间为所需的进样时间。定容进样时，蠕动泵接到S2的蠕动管，S1为样品入口，开启泵，样品节充满后，停蠕动泵，封住S1、S2，启动柱塞泵，样品节就可以在载流中混合并反应。由本分析对象的特性，实验采用了定时进样的方法。盖片上液流导入的接口采用了外径2 mm，内径200 mm的PVC管，并以AB胶封住接口地方。光信号的检测采用CR105-PMT(日本HAMAMATSU公司)，光电倍增管光窗根据体系需要放在距离废液出口一定距离处，芯片的其它部分用黑色胶布封住，在反应管道正对光窗的地方留2×2 mm的地方供光信号的检测。系统信号的获取采用了西安瑞迈电子科技有限公司的MCDR-A型多功能化学分析数据处理系统以及IFFL-DM多功能流动注射化学发光/光谱/光度分析系统分析软件。对Luminol-H2O2-Co2+体系的测定，同样采用定时进样，但进样口和载流入口的距离不同，因为测定Co2+的体系是快化学发光体系，所以进样口离载流入口更近。
3.3结果与讨论
3.3.1有机玻璃微芯片刻制的工艺条件
1)微管道刻制条件
有机玻璃具有较低的玻璃化温度(Tg)，易于加工，但是在加工过程中，严格控制温度较为重要。试验表明，当温度高于180℃时，加热10 min就会让有机玻璃的透光性变差。而当温度在170～180℃间，加热30 min以上有机玻璃的透光性也会逐渐变差。当温度低于170℃时，加热40 min以上有机玻璃的透光性变化也不明显，但刻制管道所需的压力和时间都会相应增长，刻制管道的过程中，温度、压力和时间是必须考虑的因素。多次试验结果表明，使用金属丝时，在170～180℃间加热，1.5 MPa压力下，保持10 min刻制的管道较好，而且所需的时间也较短；而使用玻璃负片时，压力减小到1.0 MPa以下并保持20 min。有机玻璃片应降到室温后才取出，否则高温下取出管道会膨胀变形甚至消失，有机玻璃片骤冷会弯曲。管道密封盖片上的进液孔制作时应注意温度控制，圆柱铁丝应在高温状态下进行瞬间快速烧蚀。
2)密封工艺
微管道刻制好后，把管道密封起来，让流体在其中通过是系统集成的关键步骤。玻璃、石英的键合一般用高温热键合，由于键合温度高，玻璃易破碎，其键合成功率较为低下。有机聚合物由于具有较低的玻璃化温度，所以键合起来较为容易。本方法密封的有机玻璃微管道所能承受的压力较大，实验表明，在5.0 MPa驱动压力下流体在微管道中也不会产生渗漏。本法并没有单独采用热键合的方法，因为这样耗时较长，且在高温较长时间下微管道形变较大，芯片光学性能变差。故采用先在盖片上涂覆少许四氢呋喃，合上底片，再在120℃，1.5 MPa压力下保持10 min键合。四氢呋喃应涂覆在盖片上，涂覆在底片上如果滞留在微管道中会使管道变形堵塞。采用有机溶剂的目的是加强底片和盖片的粘接能力，方法还试验了三氯甲烷，但三氯甲烷对有机玻璃的溶解能力太强易使微管道堵塞，芯片光学性能变差。
3.3.2 PDMS微芯片的刻制工艺条件
    PDMS预聚物和固化剂混合后，即在其中夹杂大量的气泡，如果不把气泡排除，则固化后制作出的微芯片上将会有许多气泡留在芯片内部，如果气泡刚好在微管道附近或者直接在微管道上，则微管道将会变形。而气泡如果在管道的其他地方，当用光学方法检测时，将会严重干扰信号。因此，在固化前，一定要将气泡排除完全。固化的初期，有可能还会产生气泡，如此时发现应立即再放入真空干燥器抽气。保持整个制作系统的清洁也是防止气泡夹入的必要措施。
分离玻璃微芯片时应小心，不应使PDMS上的微管道破损和变形。对于PDMS芯片而言，底片可以是表面平整清洁的玻璃或PMMS基片，密封一般采用直接密封粘合，无需加热或其它条件，这也是PDMS突出的优点之一。但这种方法密封强度有限，不适用于较大压力驱动流下的化学分析，对于所能承受的压力要求较高的体系，可采用等离子体键合。
盖片和底片键合时的对准是一个极为精细的操作问题，因此可以采用先制作出芯片，在切割时，在显微镜下进行切割以便于盖片液流进出口和底片相应管道对齐。
3.3.3微管道的显微观测及流体混合效能测定
显微成象技术观测表明，直径200 mm的金属丝刻制的微管道宽200 mm，深度为120 mm，管道截面呈弧形。无论是二维管道，还是三维管道结构，所制作的有机玻璃及PDMS化学芯片的微管道的表面都较化学腐蚀法刻蚀的玻璃微管道光滑，管道的均一性也较好。而且通过调节成像聚焦点观察玻璃管道的上下端面，发现玻璃管道的上下管道呈梯形的形状，这是由于腐蚀法刻蚀的缺点，上端腐蚀时间过长，因而要宽一些。使用前述方法制作了直管道、二维折叠管道、三维变向管道的化学微芯片。
 
图3.3 有机玻璃微管道形状和玻璃芯片微管道形状的对比(a 有机玻璃，b 玻璃芯片)
Fig.3.3 Channel structure comparing of PMMA-chip and glass-chip (a: PMMA, b: glass)
表3.1 微管道中两流体混合观测结果
Table 3.1 Mixed result of two fluid in micropipeline
压力(kPa)总长度(mm)折叠数(n)KMnO4，亚甲基蓝，开始混合所需管道长度(mm)罗丹明B，荧光黄开始混合所需管道长度(mm)
100cm高液柱， 500    1.0´103100cm高液柱 500   1.0´103
直管道2000150            86      58无混合       无明显混合
二维折叠管道2004103            60      46无明显混合       160
三维变向管道4008105            62      48下层管道混合  244   164
化学微芯片微管道中流体一般呈层流状态，两载流不易在微管道中混合。在显微镜下观测两颜色流体的混合状态，观测结果如表3.1所示，折叠变向管道的混合效率明显高于直管，空间变向的管道的混合效率最高。增加驱动压力可提高流体混合效率。同时，使用组装的化学微芯片系统在不同压力下驱动KMnO4和Luminol混合反应以及Luminol和H2O2混合反应，以光电倍增管检测光信号大小，系统参数设置见附录A。作出了不同压力下光信号的大小的关系图。如图3.4 a、b所示，化学发光强度随压力的上升而增强，即两载流的混合反应程度随压力的
      
a  Luminol-KMnO4混合反应发光强度    b  Luminol-H2O2混合反应发光强度
c Luminol-H2O2化学发光反应随时间改变压力后的发光强度
(从左至右的3个平台压力分别为800、1.2´103、1.4´103 kPa)
图3.4 不同压力下两反应性载流在微管道中的混合反应效率
a CL intensity of Luminol-KMnO4        b CL intensity of Luminol-H2O
c CL intensity of Luminol-H2O with varied pressure.
Fig 3.4 Mixing performance of chemical reaction by two fluids in microchannel with different pressure
(c(KMnO4)=1.0×10-4mol/L，c(Luminol)=1.0×10-4mol/L，H2O2(1:100))
增加而加剧。当压力达到一定程度时，化学发光强度已不再增强，表明两载流在该压力下已充分混合。对于快发光反应Luminol-KMnO4体系，混合完全所需的压力较小。而对反应较为缓慢的Luminol-H2O2体系，混合反应完全所需时间较长，故压力较大。
进一步，对快发光反应Luminol-KMnO4体系，在不断增大载流流动压力的情况下，同时在进样口加入Pb2+进行标准样品的测试，为了比较载流与试剂的混合以及试剂与样品的混合，在试验中选择了不同的检测点。一个检测点选择在距离废液出口12 cm的地方，另一个检测点选择在距离废液出口1 cm的地方，两种检测方式得到的谱图如图3.5所示(a图为12 cm检测，b图为1 cm检测)。
从化学发光的光谱图中看出，随着压力的增大，同一个标准样品的化学发光峰值不断上升。以上试验结果及分析表明，压力增大，增加了流体在微管道中的流速，根据第二章理论分析， ，压力增大，则流体流速增大。雷诺数 ，流体流速增加，则雷诺数相应增加，管道中流体逐渐有由层流向湍流转变的趋势。因此促进了流体混合，使化学发光反应趋向于完全，化学发光峰值上升。同时也看出，图a中Luminol-KMnO4的光谱基线也在同步抬高。而图b中Luminol-KMnO4的光谱基线不管压力的增大，始终保持同一基线水平，这可能是在图a中，化学发光反应到达检测点时，不仅试剂和样品没有充分混合，而且发光试剂Luminol和氧化剂KMnO4也没有充分混合，因此基底发光信号也在不断的上升。而在图b中，由于检测点很靠后，试剂和载流有足够的管道长度来混合，所以在到达检测点时，Luminol和KMnO4已经充分混合，基底信号不会随压力上升。此时只有样品与试剂的反应还在随压力的增大而增强，故发光峰值在不断上升。同时，在图a中，可以看出后面4个峰已经没有明显的变化，压力的增大并未使峰有明显的增高。表明在此时的压力下，样品和试剂已经充分混合。
  
                a                                  b
图3.5 连续改变流体流动压力的情况下Luminol-KMnO4体系测定Pb2+(1.0´10-4mol/L)的结果(压力在100～1.4´103kPa间变化，纵坐标I：化学发光强度值；横坐标t：时间/´0.2 s)
Fig.3.5 Determination results figures of Pb2+ with continuously changing pressure (Y-coordinate: intensity of CL, X- coordinate: time, t/´0.2 s)
从以上的试验结果分析，在微芯片中，试剂与载流以及试剂与样品的混合程度对整个分析测试的体系十分重要，而其混合程度与芯片上管道的大小、长度、空间变向等因素直接相关。改变流体流速同样能加快或减慢混合反应程度，使获得的信号增大或减小。因此，优化最佳混合条件能使获得的分析信号更加准确。
3.3.4 Luminol-H2O2-Co2+化学发光体系的测试
对Luminol-H2O2-Co2+化学发光体系进行了标准样品的测试，测试条件为Luminol浓度为1.0´10-4 mol/L，pH=10.8的Na2CO3-NaHCO3的缓冲溶液，H2O2浓度为体积比1:100，仪器测试参数见附录A2。检出限可达到10-10 mol/L，对0.1μg/mL的Co2+标样连续测定6次，测定时间为80 s，图3.6所示为0.01μg/mL和1.0 μg/mL的Co2+测试结果及所用芯片示意图。注样口S与载流入口距离为18mm，检测窗口R离废液出口E距离为20 mm。
            
       (a)                          (b)
图3.6.  a： 0.01 μg/mL和1.0 μg/mL的Co2+测试结果(纵坐标：化学发光强度值；横坐标t/s )；b：芯片示意图，载流驱动系统(日本日立K-1000流动注射分析仪上的柱塞泵)；进样系统(K-1000的蠕动泵)，检测器(日本HAMAMATSU公司CR105光电倍增管(PMT))
Fig.3.6 a: CL results of Co2+(0.01 μg/mL and 1.0 μg/mL). b: Scheme of microchip
3.3.5 Luminol－KMnO4－Pb2+化学发光体系的测试
使用上述组装的化学微芯片系统对Luminol-KMnO4-Pb2+化学发光体系进行了测试。该体系的条件详见文献[78]。芯片结构如图3.2a，进样管道口S1刻制在第二个转角处，两柱塞泵驱动KMnO4和Luminol，蠕动泵定时进样Pb2+溶液。两载流驱动压力为1.0 MPa，蠕动泵定时进样时间为1 s，光电倍增管负高压为600 V。由于KMnO4和Luminol混合立即会产生较强的发光强度，且背景较大，故在缓冲液中加入体积比1:10的EDTA(1.0´10-4 mol/L)可有效的抑止基底信号，同时Pb2+应滞后加入，故进样管道在第二个转角处，注样前的混合管道长度为7 cm。对Pb2+标准样品进行测试，测试结果表明其在1～103 mg/mL都呈良好的线性关系，线性方程为：y=28.183x+194.67，y:化学发光强度值，x:浓度(mg/mL)。相关系数R=0.9976。对单个标准样品(1.0×10-5 mol/L)连续测定9次，相对标准偏差为2.3%。实验结果表明，本方法制作的微流芯片和本组装系统具有较好的性能。
3.4 结论
试验研究了用于化学微分析系统的有机玻璃化学微芯片的制作工艺过程，制作过程的技术条件及参数控制，以及PDMS材料芯片的制作条件。研究出了一条能在普通实验室制作化学微芯片的技术路线。通过和标准光刻、化学腐蚀法制作的玻璃芯片的对比，表明本法提出的采用压印技术制作的微管道具有较好的内壁表面，实验测试结果也表现出较好的重现性；同时实验观测了两载流在微管道中的混合状况，对比不同形状微管道中及不同驱动压力下流体的混合效率，发现具有折叠的管道的混合效率比直管高，三维变向管道的混合效率最高。
对Luminol-KMnO4-Pb2+和Luminol-H2O2-Co2+化学发光体系的初步测试结果表明，以本法制作的有机玻璃化学微芯片组装的微分析系统具有较好的性能。