高效前沿分析介绍

高效前沿分析介绍
高效前沿分析(high performance frontal analysis，HPFA)是近几年发展起来的一种能同时测定药物与蛋白结合平衡中游离药物和总药物浓度的一种新的色谱方法。它克服了传统药物一蛋白结合分析方法的不足，使分析更加快速、准确、有效。利用高效液相色谱(HPLC)和高效毛细管电泳(HPCE)系统可以有效地进行HPFA。在药代动力学研究中，用HPFA方法，通过测定峰高和峰面积得到游离药物和总药物浓度，可同时了解药物蛋白结合情况并测得生物利用度等药动学参数。另外，HPFA相当于药物的富集，大大提高了药物的检测限。
1、HPFA的历史
     前沿分析法(frontal analysis，FA)是由James和Philips， 1964年首先提出并将其用于单组分等温线的测定。FA实验过程是在色谱柱入口处每隔一定时间连续压入大量浓度不断递增的待测样品。在FA中，对每一个浓度的样品，进样量要足够大，以保证其洗脱曲线中与进样浓度呈线性关系出现浓度平台。由于FA在测定单组分等温线时仅需要洗脱前沿出现时的保留时间和与其浓度相对应的平台高度，可以克服由低浓度数据点产生的误差所造成的整个等温线偏离的缺陷。Sebille等 将FA的原理、方法用于药物与蛋白结合的研究中，特别适用于高蛋白结合率或游离药物浓度很低时的分析。HPFA方法研究药物血浆蛋白结合时，所采用的流动相是模拟人体生理环境(pH7．4，离子强度0．17)的磷酸盐缓冲液，以含有药物和蛋白的平衡溶液直接进样，可以反映药物在体内与蛋白结合的真实情况。
      HPFA包括HPLC／FA和HPCE／FA。HPFA法最早采用的是带有限制性色谱柱的HPLC法，称为HPLC／FA，但其所需样品量较大，使应用受到一定限制。采用毛细管电泳进行前沿分析可以满足微量样品的测定，这种方法称为HPCE／FA。当今，在药物蛋白结合研究中，它已成为一种非常有吸引力的技术。HPCE／FA兼顾了FA和CE的特点，克服了其它分析方法的缺陷。
      2 HPFA的原理
      Shibukawa等㈨详细阐明了I-IPFA的原理。在此系统中，药物一蛋白混合液直接进样于一种特殊色谱柱(restricted— access—type column)，它可将大分子蛋白质排除在外，而将小分子药物保留在柱填料微孔中的固定配基上，即进样后，样品中结合型药物迅速从流动相的复合物中释放出来，渗透进入柱填料微孔中，保留在其固定配基上。若进样量少，样品溶液被流动相稀释，结合的药物不断从蛋白复合物中释放，总量药物(结合型药物+游离药物)以单峰的形式被洗脱出来，尽管能从峰面积测得总药物浓度，但不能测得游离型药物浓度。若连续进样到足够量，结合型药物从血浆蛋白复合物中的释放受到抑制，最终可在近柱顶端填料的间隙中产生一个稳态平衡区域。这个区域存在两种平衡：填料间隙中的药物一蛋白结合平衡和微孔中药物的色谱分配平衡。间隙中蛋白质浓度与样品溶液相同，微孔流动相中药物浓度等于间隙中游离药物浓度，因此平衡区域间隙中的药物一蛋白结合平衡与样品溶液中一致。进一步的进样不会干扰结合平衡，但可使平衡区扩展。蛋白的柱中迁移比游离型药物
快，而结合型药物由于与蛋白结合，只能与蛋白质共同迁移。当结合型药物随着蛋白的迁移从平衡区域中洗脱出来后，迅速从蛋白中释放出来，转变成游离型，这种释放有助于平衡
区域的扩展，形成峰形上的平台区。进样结束后，蛋白质首先被洗脱，然后药物以具有平台区域的梯形峰的形式被洗脱出来，形成HPFA的基本峰形。
    平台区域的出现是由于平衡区域中游离型药物的洗脱，平台区域的药物浓度与样品溶液中的游离型药物浓度一致，因此游离型药物浓度能根据平台高度测定。如果药物峰能与蛋白峰完全分离，还可根据峰面积测定总的药物浓度。平台区域的出现是HPFA法研究蛋白结合的必要条件。
3 HPFA的特点
HPFA具有以下几个特点：(1)在HPFA中，允许直接进样，进行自动分析，省去不必要的环节，减少误差，克服了传统分析方法带来的缺点；(2)在HPFA中，当药物峰与蛋白峰完全分离时，可同时从药物平台峰的峰面积和峰高计算出总药物浓度和游离药物浓度；(3)HPFA可以连接到在线的高效液相色谱或毛细管电泳系统中，使得分析更加快速、准确、简便；(4)HPFA中由于“调节效应(regulationefect)”H J，平台区域的洗脱体积比最初注射体积大，这种
效应大大提高了样品的检测限。可用于蛋白结合率很高、游离药物浓度极低的药物研究。例如，曲格列酮的蛋白结合率为99．87％ ，在血浆中游离药物浓度为0．27±0．08nmol／L(n=5) ；司莫地平的蛋白结合率为99．4％ ，在血浆中游离药物浓度为3．02±0．07nmol／L(n=5)，利用HPFA进行测定得到了非常好的重现性；(5)HPLC／FA中串联一个手性HPLC柱，或在HPCE／FA中与毛细管电泳手性拆分技术相结合，可分别得到外消旋体中两个对映体的平台峰，求得蛋白结合参数；(6)HPCE／FA中，可以分析纳摩尔级的样品，或进行纳升量样品的测定。这对分析药物与缺乏的或较难获得的蛋白质(如脂蛋白、d一球蛋白等)的结
合研究是非常有利的。在药动学研究中，房室模型的确立直接关系着药代动力学参数测定的准确性。随着药物在体内的代谢，血药浓度逐渐降低，提高检测限对获得正确的房室模型是非常重要的。HPCE／FA恰好解决了这个问题。
     4 l CE／FA应用实例
     Shibukawa等 采用HPCE／FA方法测定蛋白结合平衡中游离型异搏定(verapam／1，VER)的浓度。将毛细管内表面用聚丙烯胺处理，以磷酸钠缓冲液(pH7．4，离子强度0．17)为电泳背景。毛细管充填缓冲液后，其进样末端浸入样品液，进样10秒，然后将进样端浸入流动相缓冲液中，施加+IOKV电压洗提，后得VER呈带状峰，根据其峰高即可计算出游离VER浓度。这是由于毛细管内表面用聚丙烯胺处理过，硅和碳之间以Si—C键结合，在+10KV电压和pI-I7．4条件下不会产生电渗流动，带负电荷的蛋白(HAS和d一酸性糖蛋白)不向测量端泳动，而只有带正电的游离型VER向测量端泳动，出现VER峰。在HPFA中，药物的平台峰形是前沿分析测定游离型药物的必要条件，而HPCE仅需80nl样品就足以获得平台峰。用HPCE／FA法测定了5种比例的VER／HAS溶液中游离VER浓度，与用超滤HPLC法测定的结果相符，估算出的结合常数及每个蛋白分子的结合部位数也与文献值相符。
       5 HPFA在药代动力学研究中的应用前景及有待解决的问题
          HPFA在药动学研究中具有广阔的应用前景。生物体内的聚合体，特别是未知的多肽、蛋白质以及它们的次级转化衍生物的功能研究倍受关注。HPFA不仅可以用来分析药物与蛋白之间的相互作用，而且可以用来研究存在着快速和可逆平衡的任何物质之间的相互作用，特别是为内源性活性物质与这些生物聚合物的作用的研究提供了快速、准确的分析方法。HPFA是一种新的色谱方法，尚有许多工作有待完善，需要进一步深入研究，比如，用HPCE／FA进行酸性药物与蛋白结合的研究以及色谱条件的优化选择，建立起一套完善的研究手段，为在药动学其它方面的研究中应用提供可行性论证等。HPLC／FA方法在进行对映体与蛋白结合的研究中，需要手性拆分柱，HPCE／FA方法需要手性拆分试剂的选择，手性拆分条件的确定显得尤为重要。随着研究的深入，高效前沿分析将具有广阔的应用前景