HCV NS3 N末端部分氨基酸缺失

欧武　杨翠红　朱千政　邓小艺　于曼　秦鄂德　杨佩英

　　【摘要】　目的　旨在弄清NS3参与分子间相互作用的确切区段，为研究针对NS3的抗HCV寡肽小分子药物的设计提供依据。 方法　参照HCV中国河北株序列设计NS3引物，将其N末端的前15个和前30个氨基酸分别缺失掉。然后用酵母双杂交系统检测NS3/NS3及NS3/NS4A分子间相互作用强度在缺失前后的变化，从而判明NS3 N末端氨基酸在分子间相互作用中的意义。核苷酸序列分析采用Applied Biosystem 373A型自动测序仪。 结果　NS3 N末端氨基酸缺失前后，NS3/NS3分子间及NS3/NS4A分子间相互作用的强度相差有显著性（P<0.01），但缺失15个氨基酸和缺失30个氨基酸对上述相互作用强度的影响差异无显著性（P>0.05）。　结论　NS3 N末端的1～30个氨基酸在NS3/NS3及NS3/NS4A分子间相互作用中有一定意义，其N末端前15个氨基酸（APITAYSQQTRGLLG）对于分子间相互作用更为关键。本研究结果将为抗NS3丝氨酸蛋白酶活性的寡肽抑制物的研究打下基础，并为抗HCV的寡肽小分子药物的设计提供依据。
　　【主题词】　丙型肝炎病毒　　氨基酸缺失　　酵母

The influence of HCV N-terminal deletion on the molecular interactions betweem NS3/NS3 and NS3/NS4A　Ou Wu, Yang Cuihong, Zhu Qianzheng, et al. Department of Virology, Institute of Microbiology and Epidemiology, AMMS， Beijing, 100850
　　【Abstract】　Objective　The formation of NS3 serine protease crystal, NS3/NS4A complexity, and the results of two-hybrid detection of NS3 and NS4A confirm the reality of interaction between NS3 and NS3, between NS3 and NS4A as well. But the precise domain of NS3, directly participated in the interactions, is not known now. This study is aimed at locating the domains directly participated in molecular interactions of NS3/NS3 and NS3/NS4A, and providing some valuable references to the research of anti-HCV oligopeptide drug，which inhibits NS3 serine protease activity. Methods　In designing NS3 primers, the sequences encoding the first fifteen and thirty amino acids of NS3 N-terminal were deleted respectively. By comparing the strength between NS3/NS3 and NS3/NS4A molecular interaction, pre- and post-deletion the function of amino acids of NS3 N-terminal in molecular interaction was analyzed. The applied biosystem 373A sequencer was used for DNA sequencing. Results　The pre- and post-deletion interaction strength difference between NS3/NS3 and NS3/NS4A was significant(P<0.01), but the difference between 15-amino acids deletion and 30-amino acids deletion was insignificant(P>0.05). Conclusions　Our study suggests that the first thirty amino acids are important in NS3/NS3 and NS3/NS4A interaction, and the first fifteen oligopeptides(APITAYSQQTRGLLG), located at N-terminus of NS3, are more critical. This oligopeptides may be useful in designing the small molecule inhibitor of NS3 serine protease activity.
　　【 Subject words 】　Hepatitis C virus　　Amino acid deletion　　Protein interaction　　Yeasts

　　HCV是单股正链RNA病毒，基因组全长约9.4kb, 编码一条长约3010个氨基酸的蛋白前体。在病毒蛋白前体的加工过程中HCV NS3丝氨酸蛋白酶起着重要作用^〔1〕。NS3丝氨酸蛋白酶体外晶体的形成^〔2〕，体内NS3/NS4A复合体，以及用酵母双杂交系统对NS3/NS3、NS3/NS4A分子间相互作用的分析结果均证实了NS3/NS3、NS3/NS4A分子间相互作用^〔3，4〕。但关于NS3参与分子间相互作用的确切区段尚不清楚。本研究采用PCR技术和酵母双杂交系统对该问题进行了初步探讨。

材料与方法

　　1. 酵母双杂交系统：CLONTECH Laboratories, INC 产品。酵母双杂交系统以lac Z作报道基因，GAL4是其转录因子。质粒pGBT9、pGAD424分别编码GAL4的结合区和激活区，外源基因分别与这两个区域重组形成融合基因，如果外源基因编码的蛋白分子存在相互作用，即可诱导lac Z基因表达产生β-galactosidase. 检测β-galactosidase活性即可判断蛋白分子间的相互作用。
　　2. 引物：参考HCV中国河北株设计，对HCV NS3 N 末端前30个氨基酸和前15个氨基酸分别进行缺失。HCV NS3 N 末端30个氨基酸缺失引物： P1(3170～3187 nt): 5‘ CGGAATTCGGTGAGGTCCAGATCGTG 3‘; P2(3605～3622 nt): 5‘ AACTGCAGGGACCTCATGGTTGTCTC 3‘ ； HCV NS3 N末端15个氨基酸缺失引物： P3(3125～3142 nt): 5‘ CGGAATTCTGTATAATCACCAGCCTGACT 3‘； P4(3605～3622nt):5‘ AACTGCAGGGACCTCATGGTTGTCTC 3‘
(军事医学科学院放射医学研究所合成)。
　　3. NS3片段：克隆于pGEM-T载体, 本室提供。
　　4. pGBT9-NS4A、pGAD424-NS4A重组质粒：本室提供。
　　5. NS3 N 末端缺失基因的克隆与鉴定：以pGEM-T-NS3为模板， 在94℃ 1分钟、60℃ 1分钟、72℃ 3分钟条件下扩增30个循环获得HCV NS3 N末端缺失30个氨基酸和缺失15个氨基酸的基因片段（NS3^30aa- 、NS3^15aa-），分别定向克隆（Eco RⅠ/Pst Ⅰ）于pGBT9、pGAD424和pUC18质粒，采用双酶切进行鉴定，参考文献〔5〕。限制性内切酶，Taq 酶等分子生物学常用试剂购自Promega 公司。
　　6. 核酸序列分析：Applied Biosystem 373A型自动测序仪。
　　7. 酵母双杂交系统检测蛋白分子间相互作用：用LiAc法制备酵母细胞（SFY526）感受态, 重组质粒（实验设置详见结果部分）共转染后，分别以X-gal和 ONPG为底物定性和定量检测蛋白分子间相互作用，详见试剂盒说明书。
　　7. 统计学方法：t检验。

结　果

讨　　论

　　在酵母双杂交系统中，HCV NS3 丝氨酸蛋白酶N 末端的前30和前15个氨基酸缺失后，NS3/NS3, NS3/NS4A分子间相互作用强度明显减弱, 说明所缺失的氨基酸对于介导NS3/NS3, NS3/NS4A分子间相互作用有重要意义。但是缺失30和15个氨基酸对分子间相互作用的影响差别无显著性，提示HCV NS3 丝氨酸蛋白酶N末端前15个氨基酸（APITAYSQQTRGLLG）对于介导NS3/NS3, NS3/NS4A分子间相互作用可能是主要的。而其后的15个氨基酸的影响不明显。由于HCV NS3 丝氨酸蛋白酶的高度保守性，本实验的结果在实际应用上具有一定意义。设计与前15个氨基酸具有高度同源性的寡肽小分子，通过酵母三杂交系统^〔6〕掺入到NS3酶反应体系中，与NS4A竞争相互作用位点，影响NS3多聚体和NS3/NS4A复合体的形成，从而抑制HCV NS3丝氨酸蛋白酶活性，干扰病毒的复制。因此，通过此方法可望筛选出对HCV具有抑制作用的寡肽小分子, 对抗HCV小分子药物的研究具有一定意义。对该区段作点突变分析，将会获得更为直接、精确的资料。

　　作者单位：100850 北京，军事医学科学院微生物与流行病研究所病毒室（欧武，朱千政，邓小艺，于曼，秦鄂德，杨佩英）；大连医科大学病理生理学教研室（杨翠红）

参　考　文　献

　1　D‘Souza EDA, Grace K, Sangar DV, et al. In vitro cleavage of hepatitis C virus polyprotein substrates by purified recombinant NS3 protease. J Gen Virol，1995，76∶ 1729-1736.
　　2　Kim JL, Morgenstern KA, Lin C, et al. Crystal structure of the hepatitis C virus NS3 protease domain complexed with a synthetic NS4A cofactor peptide. Cell，1996，87∶ 343-355.
　　3　Failla C, Tomel L, Francesco RD. Both NS3 and NS4A are required for proteolytic processing of hepatitis C virus nonstructural proteins. J Viral， 1994，68∶ 3752-3760.
　　4　Tanji Y, Hijikata M, Satoh S, et al. Hepatitis C virus-encoded nonstructural protein NS4A has versatile functions in viral protein processing. J Virol， 1995， 69∶ 1575-1581.
　　5　萨姆布鲁克. 分子克隆实验指南. 金冬雁译，第二版，北京：科学出版社，1992，p34-60.
　6　Licitra EJ , Liu JO. A three-hybrid system for detection small ligand-protein receptor interactions.Proc Natl Acad Sci USA, 1996, 93∶ 12817-12822.