分光光度法实验方案

2、实验内容提要
2.1 吸收曲线的绘制，选择最大吸收波长
2.2标准曲线的绘制，相关系数、回归方程的计算
2.3未知样的测定

3、实验原理
在可见分光光度测定中 ，通常是将被测物质与显色剂反应，使之生成有色物质，然后测定其吸光度，进而求得被测物质的含量。因此，显色反应的完全程度和吸光度的测量条件都会影响到测定结果的准确性。为了使测定有较高的灵敏度和准确度，必须选择适宜的显色反应条件和仪器测量条件。通常所研究的显色反应条件有显色温度和时间、显色剂用量、显色液酸度、干扰物质的影响及背景消除等。
条件试验的一般方法是暂时固定其他因素，改变其中一个因素，显色反应完成后，测量相应的吸光度，通过绘制吸光度—因素（考察的条件）曲线确定最适宜的条件。
本实验以过量的盐酸羟胺作为还原剂将Fe3+还原为Fe2+，控制溶液的PH值在5-9之间，以α,αˊ-联吡啶作为显色剂其与Fe2+生成稳定的红色络合物。在520nm的波长下，测定有色溶液的吸光度。
4Fe3++2NH2OH=4Fe2++N2O+H2O+4H+

4、实验仪器与试剂
4.1 UV-160型分光光度计
4.2 3cm玻璃比色皿；
4.3 10ml吸量管1支；
4.4 2ml吸量管2支；
4.5 100ml容量瓶（7只）；
4.6 α,αˊ-联吡啶：0.1%
4.7 盐酸羟胺：5%
4.8 硫酸溶液：25%（V/V）
4.9 10µg/ml铁标准溶液：称取0.8643g（精确至0.0001g）硫酸铁铵（NH4Fe(SO4)2•12H2O）置于50ml烧杯中，加入10ml的硫酸溶液（4.8），溶解后，移入1000ml 容量瓶中，用水稀释至刻度。准确吸取此溶液5ml，移入100ml溶量瓶中再用水稀释至刻度，即得到5µg/ml铁离子标准溶液

5、实验步骤
5.1 吸收曲线的制作及最佳吸收波长的选择
用吸量管移取5.00ml、5µg/ml的铁标准溶液，注入100ml容量瓶中，加入5%盐酸羟胺溶液20ml摇匀，加入0.1%α,αˊ-联吡啶10ml,用去离子水稀释至刻度，摇匀。在UV-160型分光光度计上，在460-560nm之间，进行光谱扫描，扫描结束后，仪器会得到一条以波长为横坐标，吸光度为纵坐标的吸收曲线，从曲线上选择最大的吸收峰处作为测定铁时的适宜波长（一般选用最大吸收波长λmax ）。

5.2 工作曲线的制作
在7只100 ml容量瓶中，用10ml 吸量管分别加入0.00，1.00，2.00，3.00，4.00，5.00，6.00ml铁标准溶液（C=5μg.ml-1),再加入5%盐酸羟胺溶液2 ml，0.1%α,αˊ-联吡啶2 ml，然后再以去离子水稀释至刻度，摇匀，放置15min。在所选定的波长（520nm）下，用3cm比色皿，以空白试剂调零后，逐个测定以上各标准溶液的吸光度。以100ml溶液中的含铁量为横坐标，相应的吸光度为纵坐标，绘出工作曲线。

5.3 铁含量的测定
准确移取5.00ml 待测试样于100ml容量瓶中，依次加入5%盐酸羟胺溶液2 ml, 0.1%α,αˊ-联吡啶2ml, 再以去离子水稀释至刻度，摇匀。在所选定的波长下测定其吸光度 。UV-160型分光光度仪将根据以上制作的工作曲线自动计算出待测试样中铁的含量（以μg.ml-1表示)。

6、实验数据记录及处理
6.1波长---吸光度曲线图：
UV-160型分光光度仪可以根据所选择的波长范围，进行自动扫描，并显示出吸光度为纵坐标、波长为横坐标的吸收曲线，以此来选择测量的最适宜波长。

6.2 标准曲线的制作和试样的测定
6.2.1标准溶液的测定记录及相关计算
标准溶液的吸光度测定结果（表1）
        标准溶液
吸取溶液/ml        1        2        3        4        5        6
Fe的含量
（μg.ml-1）                                                
吸光度A                                                
实验时间： 实验者：
根据表1中的所得的实验数据，可以计算出
Fe的含量与吸光度的相关系数：
r=
Fe的含量（C）与吸光度（A）的回归方程：
C = k•A + b

6.2.1 待测溶液的测定记录

待测溶液的测定结果（表2）
        1        2        3        平均
吸光度                                
待测试样含量                                
分析时间： 分析者：