百萤 D-荧光素钾盐实验方案

D-荧光素是流行的多功能生物发光底物，也是比较常见的实验试剂，下面请跟着百萤一了解D-荧光素钾盐的实验过程吧!

一、D-荧光素钾盐和5-氟-荧光素，作为Luciferase的作用底物，常用于以下实验：

1. 报告基因分析

2. In vivo imaging (动物活体成像)

3. In vitro imaging (细胞体外分析)

4. ATP测定

5. 其它luciferase及其基因相关的分析和研究工作

二、实验方案

以下方案是钾盐和钠盐制备的一个例子，它可以适用于大多数细胞类型和体内动物用途。

1.用于体外生物发光图像测定的实施方案

1.1在无菌水中制备100mM（100-200X）荧光素原液。混合均匀。立即使用，或单独使用等分试样，并储存在-20°C，避免冻融循环，避免暴露在光线下。

1.2在预热的组织培养基中制备0.5-1mM D-荧光素的工作溶液。

1.3从培养细胞中分离培养基。

1.4将荧光素工作溶液加入细胞中，并在成像前将细胞在37°C孵育5-10分钟。

2.用于体内生物发光图像测定的实施方案

2.1在DPBS中制备15mg / mL荧光素储备溶液，不含Mg2+和Ca2+。 混合均匀。

2.2过滤器通过0.2μm过滤器过滤溶液。立即使用，或单独使用等分试样，并储存在-20°C，避免冻融循环，避免暴露在光线下。

2.3在动物体重150mg / kg（或10μL/ g荧光素储备溶液）成像前10-15分钟腹膜内（i.p.）注射荧光素。

注意：应对每种动物模型进行荧光素的动力学研究，以确定峰值信号时间。

3.荧光素报告分析分子测定的实施方案

3.1在无菌水中制备100mM荧光素储备溶液。 立即使用，或单独使用等分试样，并储存在-20°C，避免冻融循环，避免暴露在光线下。

3.2制备1mM D-荧光素的工作溶液，其中含有3mM ATP，1mM DTT和15mM MgSO 4的25mM tricine缓冲液，pH7.8。

3.3将5-10μl细胞裂解液移入微孔板中。使用不含裂解液的裂解试剂或缓冲液作为空白。

3.4根据制造商的说明，使用荧光素工作溶液的普利光度计。

3.5注入200μl荧光素工作溶液，无延迟，10秒积分时间。

注意1：D-荧光素钾盐溶于无菌水和缓冲液，溶解度可高达25mg/mL。一般使用浓度为3-15 mg/mL。溶液的pH值、溶液中的氧气和保存时间对其保存过程中的稳定性非常重要。当溶液的pH<6.5（发生水解作用）或>7.5（发生消旋化作用，D型转化为L型）的情况下，D-荧光素钾盐相对不稳定。如果溶液中存在少量的氧气，将加速D-荧光素钾的降解速度。储备溶液可以在不含ATP的水中制备，并在-20°C下避光储存。必须用适当的碱中和游离酸溶解。

注意2：D-荧光素可与任何现有的文献或ATP分析系统一起使用。

注意3：如果检测ATP，请戴上手套并使用无ATP容器，尽量减少所有可能的ATP污染源。仅使用无菌无ATP水和试剂。使用高压水进行所有试剂制备。

三、试剂应用文献

Bioluminescence imaging of Arc expression in mouse brain under acute and chronic exposure to pesticides
Authors: Izumi, Hironori and Ishimoto, Tetsuya and Yamamoto, Hiroshi and Mori, Hisashi
Journal: NeuroToxicology (2018)

Cytotoxicity Burst? Differentiating Specific from Nonspecific Effects in Tox21 in Vitro Reporter Gene Assays
Authors: Escher, Beate I and Henneberger, Luise and K{\"o}nig, Maria and Schlichting, Rita and Fischer, Fabian C
Journal: Environmental health perspectives (2020): 077007

IL4I1 is a metabolic immune checkpoint that activates the AHR and promotes tumor progression
Authors: Sadik, Ahmed and Patterson, Luis F Somarribas and {\"O}zt{\"u}rk, Selcen and Mohapatra, Soumya R and Panitz, Verena and Secker, Philipp F and Pf{\"a}nder, Pauline and Loth, Stefanie and Salem, Heba and Prentzell, Mirja Tamara and others,
Journal: Cell (2020): 1252--1270

Bioluminescence reporter for monitoring G2-phase cell cycle arrest in vivo.
Authors: Yu, Jian-Bo and Jing, Ya-Jie and Jin, Zai-Shun and Li, Qi and Meng, Xiang-Yu and Chen, Zhi-Hong
Journal: Pakistan Journal of Pharmaceutical Sciences (2020)

Genome-wide microRNA analysis identifies miR-188-3p as novel prognostic marker and molecular factor involved in colorectal carcinogenesis
Authors: Pichler, Martin and Stiegelbauer, Verena and Vychytilova-Faltejskova, Petra and Ivan, Cristina and Ling, Hui and Winter, Elke and Zhang, Xinna and Goblirsch, Matthew and Wulf-Goldenberg, Annika and Ohtsuka, Masahisa and others, undefined
Journal: American Association for Cancer Research (2016): clincanres--0497

C3-Luc Cells Are an Excellent Model for Evaluation of Cellular Immunity following HPV16L1 Vaccination
Authors: Li, Li-Li and Wang, He-Rong and Zhou, Zhi-Yi and Luo, Jing and Wang, Xiao-Li and Xiao, Xiang-Qian and Zhou, Yu-Bai and Zeng, Yi
Journal: PloS one (2016): e0149748

Identification of a novel protein kinase a inhibitor by bioluminescence-based screening
Authors: Ishimoto, Tetsuya and Azechi, Kenji and Mori, Hisashi
Journal: Biological and Pharmaceutical Bulletin (2015): 1969--1974

Identification of a Novel Protein Kinase A Inhibitor by Bioluminescence-Based Screening
Authors: Ishimoto, Tetsuya and Azechi, Kenji and Mori, Hisashi
Journal: Biological and Pharmaceutical Bulletin (2015): 1969--1974