丝瓜提取物对衰老小鼠学习记忆力、脑组织形态学及免疫功的影响

丝瓜提取物对衰老小鼠学习记忆力、脑组织形态学及免疫功的影响

目的:观察丝瓜提取物对衰老小鼠学习记忆能力、脑组织形态学及免疫功能的影响。

方法:经筛选的昆明种小鼠随机分为对照组、衰老组、ALL瓜提取物187.5 mg/kg,375 mg/kg,750 mg/kg3个剂量组。除对照组以外，均在颈背部皮下持续注射D伴乳糖复制衰老模型，利用跳台实验及Morris水迷宫测试各组小鼠学习记忆能力，脏体比方法测定各组小鼠脑指数、胸腺指数和脾脏指数，ELISA法检测各组小鼠血清中细胞因子ILK, IFN、的浓度和T淋巴细胞增殖活性，HE染色法观察各组小鼠脑组织形态学变化。结果:衰老组在跳台实验的能力测试中错误次数增多;在水迷宫测试中逃避潜伏期延长，平台象限游泳时间缩短，穿越平台次数减少;脑组织细胞数量明显减少;脑指数、胸腺指数和脾脏指数减少;IL 2,IFN、水平和T淋巴细胞增殖活性降低;与衰老组比较，丝瓜提取物(375 mg/kg,750mg/kg)可明显拮抗上述指标变化。结论:丝瓜提取物可以改善衰老小鼠的学习记忆，同时增加机体免疫活性，达到延缓衰老进程的作用。

关键词 丝瓜提取物;衰老;;D-半乳糖;学习记忆能力;形态学

衰老是分子、细胞、器官乃至整个机体功能衰退的复杂的生理、病理变化过程。学习和记忆能力减退是脑功能衰退的表现，其机理是氧自由基介导的脂质过氧化效应。丝瓜系葫芦科植物具有丰富的营养价值。有报道丝瓜提取物有抗应激、抗病毒、促进生长及增强免疫等功能。有研究显示丝瓜的果、叶和藤的提取物可增强正常小鼠腹腔巨噬细胞内酸性磷酸酶的活性以及巨噬细胞吞噬功能的作用。证明丝瓜提取物对正常小鼠免疫功能的影响。丝瓜中分离得到的黄酮类物质可能是其发挥体内抗氧化作用的主要物质。而丝瓜提取物对衰老模型小鼠的免疫调节作用还少见报道，实验主要观察丝瓜提取物对D-半乳糖致衰老小鼠行为记忆及免疫调节的影响。

材料与方法

1. 1试验药物 丝瓜提取物为比例提取物，由西安森冉生物有限公司提供，通过80目筛，棕黄色精细粉末，1g提取物相当于15g生药。脑复康(毗拉西坦片)，购自上海信谊药厂有限公司，批号:201309030

1.2动物 选取72只雄性昆明种小鼠，SPF级，体重25 -35g，许可证号:SCXK(预)2010-00020

1.3试剂 D-半乳糖(上海试剂二厂);RPMI-640培养液(上海元龙生物技术有限公司)

1.4仪器  XR-3TB小鼠跳台分析系统(上海欣软信息科技有限公司)，XR-XM101 Morris水迷宫(上海欣软信息科技有限公司)，高速冷冻离心机(上海创赛科学仪器有限公司)，酶标仪(ELX一80型)，紫外可见分光光度计(上海精密科学仪器有限公司)，C02培养箱(BPN-150CH)。

1.5方法 小鼠按体重随机分为正常组、模型组、丝瓜提取物187.5 mg/kg,375 mg/kg,750mg/kg剂量组;除正常组外，其余各组小鼠颈背部皮下注射D伴乳糖150mg/kg，连续8周，诱导衰老模型;同时，阳性对照组小鼠灌胃给予脑复康800mg / kg、分别灌胃给予187.5 mg/kg,375 mg/kg,750mg/kg剂量的丝瓜提取物，同时正常组和模型组小鼠给予等体积的0. 9%生理盐水灌胃。8周后，对各组小鼠的学习记忆能力进行测试。

1. 5. 1跳台实验 待环境适应3min后取出，箱底通以36V的交流电，其正常反应是跳到平台上以躲避电击，将小鼠放入绝缘平台上，动物从跳到平台上至第1次跳下的时间为潜伏期和5min内受电击的次数(错误次数)，记录为学习前潜伏期和错误次数，作为小鼠的学习成绩;24h后，重复操作一次，记录学习后潜伏期和错误次数，作为小鼠的记忆成绩。

1.5.2Morris水迷宫定位航行实验及空间探索实验 水迷宫的水池分为4个象限，迷宫上方安置着连接显示系统的摄像机，同步记录小鼠运动轨迹。实验过程中水池周围的参照物保持不变。实验分为前5天的定位航行实验与第6d的空间探索实验。(1)定位航行实验:历时5天，每天1次。分别从四个象限将小鼠头朝池壁入水，自动摄像系统和计算机分析处理系统处理，记录小鼠120秒内找到平台的时间(即逃避潜伏期)。超过120秒找不到平台，可引导其找到平台，滞留平台15秒，逃避潜伏期记成120秒。(2)空间搜索实验:第6天撤去平台，小鼠随机在一象限而向池壁放入水中，之后入水均固定于此象限，记录120秒内平台所在象限的游泳时间和穿越平台次数。

1.5.3小鼠脑、胸腺和脾脏指数测定 学习记忆实验结束后，准确称其体质量后脱颈椎处死小鼠，超净工作台中无菌取出全脑、胸腺和脾组织，用预冷的生理盐水反复冲洗，用滤纸吸干后，用电子天平称其重量，训一算各脏器指数，脏器指数=脏器质量( mg)/小鼠体重(g)

1.5.4 T淋巴细胞转化实验 处死小鼠后，按常规无菌操作取小鼠脾脏制备成脾细胞悬液，调整细胞浓度为1 x 10} /ml。在96孔细胞培养板的每孔加脾细胞0. 2m1， ConA 15ul，其终浓度为6ug/ml，1个样品设3个复孔，以不加ConA为对照·加盖置入5 % C02。 37℃条件下的培养箱中培养72h。在酶标仪波长560nm处测A值，计算刺激指数(SI)=实验孔A值/对照孔A值。

1.5.5   ELISA法检测 血清中细胞因子ILK , IFN、的浓度 取全血标本离心20分钟，取上清液进行检测，严格按eBioscienc;e公司提供的EI1SA试剂盒中的检测方法测定血清中细胞因子IL 2 ， IFN-r的浓度。用酶标仪在450nm波长依序测量各孔的光密度(OD值)。

1.5.6形态学观察 各组小鼠跳台实验结束后，立即处死，迅速取脑组织，并在中性福尔马林溶液中固定，常规石蜡包埋，切片，HE染色，光学显微镜下观察脑组织神经元细胞形态变化。

2结果

2. 1对D-半乳糖诱导的衰老小鼠跳台实验中学习记忆的影响

  测试学习能力中，与正常对照组相比，衰老组痴呆小鼠跳上跳台潜伏期明显延长，错误次数增多，有统计学意义;与衰老组对比，脑复康组和丝瓜提取物375 mg/kg,750mg/kg剂量组痴呆小鼠潜伏期和错误次数显著降低，有显著差异。在测试记忆能力中，与正常对照组相比，衰老组小鼠跳下跳台潜伏期明显缩短，错误次数增多，差别有统计学意义。与衰老组对比，脑复康组和丝瓜提取物375 mg/kg,750 mg/kg剂量组小鼠潜伏期明显延长和错误次数显著降低，有显著差异。

2. 2瓜提取物对Morris水迷宫中小鼠定位航行实验及空间探索能力实验的影响 定位航行实验中，各组小鼠逃避潜伏期随着训练时间的延长逐渐缩短;第2天实验开始，衰老组较空白组小鼠逃避潜伏期显著延长，提示小鼠学习记忆功能明显损伤。第3天实验开始，与衰老组相比，丝瓜提取物750mg/kg剂量组可显著缩短痴呆小鼠找到平台的潜伏期，丝瓜750mg/kg剂量组与脑复康比较实验5天中逃避潜伏期差异无统计学意义。衰老组与对照组相比，痴呆小鼠在平台象限的游泳时间明显缩短，绕平台所在象限穿越次数减少;与衰老组小鼠相比，丝瓜提取物375 mg / kg, 750mg / kg剂量组及脑复康组明显延长小鼠在平台象限的游泳时间，丝瓜提取物各剂量组均不同程度增加痴呆小鼠穿越平台次数，其中丝瓜提取物750mg/kg剂量及脑复康组与衰老组相比具有显著性差异。

2. 3瓜提取物对D-半乳糖诱导的衰老小鼠脑、胸腺和脾脏指数的影响与对照组比较，衰老组小鼠脑指数、脾及胸腺指数均显著减少，脑复康组及丝瓜提取物375 mg/kg,750mg/kg剂

量组小鼠较衰老组小鼠脑指数、脾及胸腺指数显著增大，没有显著的剂量依赖性。

2. 4丝瓜提取物对D伴乳糖致衰老小鼠模型脾T淋巴细胞转化功能、血清中细胞因子ILK及IFN-r的影响与对照组相比，衰老组小鼠的脾T淋巴细胞转化刺激指数(SI)降低，差异有显著性意义。与衰老组相比，脑复康组及丝瓜提取物187. 5mg/kg,375 mg/kg,750mg/kg剂量组均能提高小鼠SI，差异具有统计学意义。与对照组相比，血清中细胞因子ILK与IFN-r，衰老组IL 2,IFN-r明显降低，有统计学意义;而丝瓜提取物375 mg/kg,750m刻k}剂量组均能升高小鼠血清中ILK和IFN-r，差异具有统计学意义

25小鼠脑组织光学显微镜形态学观蔡正常对照组脑组织细胞形态规则且结构清晰、排列整齐，细胞数口较多，无变性细胞。衰老模型组小鼠脑皮层变薄，脑细胞数量明显减少，排列紊乱，着色不均匀，部分核固缩，形态发生改变，可见空泡样变化。与模型组比较，脑复康组及丝瓜提取物375 mg/kg,750mg/kg剂量组虽有轻度的细胞肿胀，但细胞形态结构完整，排列整齐，数量也增多，187.5 mg/kg剂量组有少量的空泡样变化，丝瓜提取物187.5 mg/kg,375 mg/kg,750mg/kg剂量组小鼠脑组织细胞的数量和排列均明显得到改善

3讨论

    衰老是生命过程的一个必经阶段，主要表现为机体对环境的适应能力减弱以至丧失，出现多种器官组织功能的衰退。衰老和延缓衰老的研究成为世界各国解决老年问题的热点前沿

研究衰老和痴呆的动物模型很多，给小鼠注射D-半乳糖已成为常见的模拟衰老动物模型的方法，广泛用于阿尔兹海默病(AD)等神经退行性疾病的药理研究[l0} o  Morri、水迷宫的定位航行实验反映小鼠的空间认知能力;空间探索实验则反映小鼠空间记忆的能力。

结果表明，丝瓜提取物明显缩短定位航行实验中小鼠的逃避潜伏期，空间探索实验中明显延长小鼠在原平台所在象限的游泳时间，增加其穿越平台次数。跳台实验属于被动回避性反射，可以考察药物对记忆全过程的影响，同时测定药物对逃避潜伏期和安全平台期的影响，可以排除药物非特异性作用的干扰[U i7实验结果显示模型组小鼠跳台实验中学习前和学习后潜伏期缩短、错误次数增加。丝瓜提取物各剂量组延长跳台实验中学习前和学习后潜伏期、减少错误次数，改善衰老小鼠的学习记忆能力，成绩明显优于模型组。在行为学层而证明了丝瓜提取物可改善记忆的能力。光镜观察脑组织形态学显示，丝瓜提取物187. 5mg/kg,375mg/kg,750mg/kg剂量组小鼠皮层细胞数量明显增多，细胞结构改善明显，丝瓜提取物有可能通过维持细胞形态结构，减少脑神经细胞的衰老或凋亡，保护脑功能达到延缓衰老的作用。

衰老的免疫学说认为，免疫器官老化，免疫细胞及细胞因子发生改变，机体的免疫功能逐渐减弱，这些增龄性变化导致机体衰老和死亡率增加[U.. isl。组织器官的重量，特别是脑、胸腺、脾、肝、i i}F9等重要器官的重量变化是反映机体衰老程度的重要指标[Ua.isl胸腺是T淋巴细胞分化成熟的场所。脾脏参与体内的多种免疫功能。老年机体的免疫功能的降低与T细胞的变化关系很大。根据淋巴细胞转化率的高低，可判断机体的细胞免疫功能状态;白介素2 (ILK)和:干扰素(interferon gam-ma } IFN-r)都是主要由活化的T淋巴细胞产生的细胞因子，具有强大的免疫调节作用。IL一具有促进T细胞增殖分化，增强T细胞、NK细胞活性，诱导干扰素生成的作用。IFN-r可增强抗原提呈细胞与T细胞的相互作用，进而增强T细胞辅助抗体产生，可活化巨噬细胞，促进其杀伤病原体和肿瘤的能力，并可活化NK细胞，提高其杀伤能力。ILK和IFN-r水平的高低是机体细胞免疫的重要标志[U sl。本实验结果显示模型组小鼠各项免疫指标异常，免疫器官萎缩、功能减退，淋巴细胞转化能力降低，外周血IL一含量降低，较好地反映了衰老的病理生理特征。丝瓜提取物能提高衰老模型组小鼠脾淋巴细胞转化刺激指数，升高血清中ILK和IFN-r浓度水平，能显著增强衰老小鼠细胞免疫功能。

综上，丝瓜提取物可以改善衰老小鼠的记忆功能及保护细胞结构功能，有保护免疫器官、提高血清中IL一和IFN、的水平及T淋巴细胞的增殖活性作用，并可能通过增强机体体液和细胞兔疫功能而起到延缓衰老的作用。