百萤课堂之肌动蛋白的染色方案

 肌动蛋白是形成微丝的高度保守的蛋白质家族，由于其在真核细胞中的细胞内含量丰富，在微摩尔浓度范围内，肌动蛋白参与的蛋白质-蛋白质相互作用比任何其他已知蛋白质都要多。鬼笔环肽的荧光衍生物已被证明在定位固定细胞和组织中的肌动蛋白丝以及在体外观察单个肌动蛋白丝方面非常有用。

      肌动蛋白具有从其单体状态聚合成丝状肌动蛋白（F-肌动蛋白）的独特能力。F-肌动蛋白和调节蛋白之间的相互作用迅速组装和分解肌动蛋白丝，将其组织成肌动蛋白束和细胞骨架网络。这些高阶结构为多种细胞过程提供必要的结构支持，包括细胞内转运、胞质分裂、细胞运动、极性和细胞形状、基因调控和信号转导。因为肌动蛋白在许多生物过程中是必不可少的，所以研究中必须使用工具（肌动蛋白特异性抗体和鬼笔环肽衍生染色剂）来观察这些肌动蛋白结构。

               图1.核蓝DCS1死细胞染料（货号17548）

图2.MitoLite线粒体绿色荧光探针（货号22675）

图3.核蓝DCS1死细胞染料（货号23125）

图4.复合图片

荧光合成头像。使用MitoLite线粒体绿色荧光探针（货号22675）对活Hela细胞进行染色并成像。在4%甲醛中固定后，用核蓝DCS1死细胞染料（货号23125）和核蓝DCS1死细胞染料 （货号17548）对细胞进行染色。

肌动蛋白染色方案

以下是鬼笔环肽-iFluor 488标记（货号23115）对培养细胞中的F-肌动蛋白进行染色的示例方案。

注意：

1.鬼笔环肽是有毒的，应小心处理 ；     

2.在适当条件下储存时，鬼笔环肽-iFluor缀合物可稳定至少6个月，如果不立即使用，请将它储存在-20℃以下，避光并避免冻融循环。

材料：

1.鬼笔环肽-iFluor 488标记（货号23115）

2.PBS缓冲液

3.3.0-4.0%无甲醛甲醇

4.牛血清蛋白

5.细胞培养

方案如下：

1.将鬼笔环肽-iFluor488标记小瓶加热至室温，并在打开前短暂离心。

2.将30uL 1000X 鬼笔环肽-iFluor488标记DMSO溶液添加到1mL含1%牛血清蛋白中，制备1X 鬼笔环肽-iFluor488标记工作溶液，并将溶液充分混合。这使得染色溶液足以用于10个孔，每孔100uL。将未使用的1000X鬼笔环肽-iFluor488标记DMSO库存溶液等分并在适当的条件下储存。

注意：

1.不同细胞类型的染色可能有所不同。为了获得最佳性能，应相应地制备鬼笔环肽结合物工作溶液的浓度。

2.将细胞在含 3.0 - 4.0% 无甲醛甲醇的 牛血清蛋白溶液中室温固定 10 至 30 分钟。避免使用任何含有甲醇的固定剂，因为甲醇会在固定过程中破坏肌动蛋白。

3.小心吸出固定液。

4.在牛血清蛋白中冲洗固定细胞2-3次。

5.用 牛血清蛋白 中的 10 mM 乙醇胺淬灭过量的甲醛 5 分钟。

6.在 96 孔板中，向细胞中添加 100 μL/孔的鬼笔环肽-iFluor488标记工作溶液。在室温下将细胞染色 20 至 90 分钟。

7.用 牛血清蛋白 轻轻冲洗细胞 2 至 3 次，以去除多余的鬼笔环肽结合物。

8.使用配备适当滤光片组的荧光显微镜观察细胞。鬼笔环肽-iFluor488标记需要 FITC 滤光片组才能可视化。