细胞培养支原体污染来源、检测及去除

细胞培养支原体污染来源、检测及去除

一、  细胞培养支原体污染来源及主要支原体种类

支原体（Mycoplasma）是一种大小介于细菌和病毒之间（0.1 - 0.6μm），没有细胞壁、并独立生活原核生物，形态呈高度多形性，呈圆形、丝状或梨形。由于支原体直径较小，进行除菌过滤是，约1%的支原体可以直接穿过常规的0.22μm的微孔除菌滤膜，造成细胞的支原体污染。支原体污染的来源包括：（1）工作环境的污染，实验器材带来的污染；（2）操作者本身的污染（一些支原体在人体是正常菌群）；（3）已受污染的培养基、血清，或用来制备细胞的原始组织或器官的污染；（4）污染支原体的细胞造成的交叉污染。

目前，已发现的支原体品种有100多种，但根据国内外相关研究发现，大约有二十多种支原体能污染细胞，有的细胞株可以同时污染两种以上的支原体。以下13种支原体污染在全部支原体污染中所占比例超过99%。（1）M. orale、（2）M.Arginini、（3）M.Hyorhinis、（4）A.Laidlawii、（5）M.Fermentans、（6）M. salivarium、（7）M.pirum、（8）M. hominis、（9）M. agalactiae、（10）M.bovis、（11）M. buccale、（12）M. arthritidis、（13）M. pulmonis。其中尤其是前四种：M.orale（口腔支原体）、M.arginini（精氨酸支原体）、M.hyorhinis（猪鼻支原体）和A.laidlawii（莱氏无胆甾原体）所占污染比例超过95%，前8种占比超过98%。

二、  支原体污染对细胞培养的危害

1.   支原体污染的普遍性

支原体污染是细胞培养领域遇到的全球性问题，据文献报道，综合美国食品药品监督管理局（FDA）、美国模式菌种收集中心(ATCC)等机构收到的相关数据，世界各国细胞系支原体污染的平均比例为30-60%。该数据未统计中国大陆的数据，但可以确定，大陆地区的支原体污染比例与此相当，或更严重。

表1.部分国家及机构细胞系污染数据统计

2.   支原体污染的危害

     根据已发表的支原体污染研究文献，支原体污染细胞后，几乎能影响每一个细胞参数。

1）   支原体污染可能导致细胞染色体的异常和损伤，改变细胞的代谢、生长、形状、附着。

2）   支原体影响被污染细胞的基因表达。相关研究表明，支原体污染的细胞系与对照组比较，有多达200个基因表达差异达2倍以上。

3）  导致MTT等细胞毒性实验结果严重错误。支原体对MTT有额外还原作用。

4）  支原体污染能耗尽营养物，促进代谢积累，重度支原体污染导致pH改变。

5）   诱导或抑制细胞因子表达，并改变培养细胞的代谢、增殖特征及形态。支原体污染可以直接影响L-arginine的代谢

6）   支原体污染可以诱导树突状细胞成熟，这对于开展人体免疫细胞的肿瘤治疗的影响将是灾难性的。

3.     支原体污染的隐蔽性

    支原体大小约0.1 - 0.6微米，体积比病毒稍大，轻度到中度的支原体污染不会明显改变细胞培养液的浑浊度和pH值，也不会导致细胞形态或生长速度的明显改变，所以科研人员很难及时发现体外培养的细胞已经被支原体污染，进而改变了基因表达谱，显示虚假的实验数据和实验结果。通常情况下，如果不排除支原体污染因素，很多实验结果往往缺乏说服力。2013年，国际顶级期刊《Nature》明确要求，在涉及细胞培养的科研工作中，必须进行支原体检测，并排除其影响。

三、  支原体污染检测

1.     支原体检测方法概述

支原体污染严重干扰细胞实验结果，检测有无支原体污染的方法较多，可以根据自身实验室条件、检测方法便捷性等作出选择。

①电子显微镜或相差显微境观察。用扫描电镜或透射电镜，直观观察支原体形态。或者在细胞培养瓶内预置盖玻片，接种细胞在盖玻片上，培养24小时后取出用油镜观察。如有支原体，因支原体与细胞在不同平面，可发现支原体呈现暗色颗粒装。

缺点：设备要求严格，检测成本高，不适合普通实验室日常常规检测。

②DNA荧光染色法，利用支原体没有细胞膜（壁）的特性，用荧光染料Hoechst 33258染色， Hoechst 33258能与支原体DNA结合着色，在荧光显微镜下观察，呈现绿色小点。缺点：灵敏度太低，当检测成阳性时，细胞经常已经严重污染。

③固体培养法，用支原体培养基大量增殖支原体，是相对可靠的支原体检测技术。缺点：耗时长，需要数周时间才能得到结果，不适合作为细胞培养液中支原体污染的快速检测。此外，该方法不能检测猪鼻支原体，因为猪鼻支原体不能在固体培养基上形成可见的菌落，猪鼻支原体（M.Hyorhinis）约占所有支原体污染的20-50%。

④PCR法，提取细胞培养液，提取支原体，制备样品，根据支原体高度保守的16SrRNA序列设计引物（避免真核细胞或细菌DNA干扰），设置阴性，阳性对照，扩增产物经电泳后成像观察，可识别已发现的几乎全部100余种支原体。

⑤Quick Cell快速检测法，拓扑酶环化支原体DNA，在根据高保守区设计的引物引导下，采用特殊等温DNA扩增酶，61℃条件下，连续滚环式扩增支原体DNA 60分钟，根据有无支原体污染，随着扩增进程可目视实验结果。

⑥化学发光法，裂解支原体后，有底物情况下，支原体特异性的酶，能将ADP转化成ATP。ATP参与荧光素酶（Luciferase）催化底物荧光素（Luciferin）产生光的过程，所以可以通过催化底物荧光素导致的生物发光（Bioluminescence）信号来判别支原体DNA存在与否。

    综上所述，在多种支原体检测方法中，受实验条件、实验时长、便捷性等因素限制,①-④仅在很少情况下得到应用。实际科研工作中，应用最为广泛的是 ⑤ PCR支原体检测法；⑥Quick Cell快速支原体检测法；⑦化学发光支原体检测法。

2.     几种最常用支原体检测方法比较

3.     支原体检测策略及方法选择

①单个方法独立检测支原体（正确检出率80%-99.9%）

     就单个检测方法及原理而言，“化学发光法”拥有最高的正确检出率（99.9%），用时最短，应为首选方法。可选产品为Lonza公司的MycoAlert Plus Mycoplasma Detection Kit (CAT:C4056L1065，价格：约9800元/100次），或李记生物公司的“Quick Cell 支原体发光法检测试剂盒（CAT:C4056L1065，价格：1250元/50次）”。

     若受实验室条件所限没有配备化学发光检测仪，或多功能酶标仪，建议选择“Quick Cell快速检测法”，该方法1小时出结果，避免了PCR法因细胞代谢产物抑制PCR反应导致的假阴性出现，正确检出率大于99%，对设备几乎无要求，可目测结果。产品可选李记生物公司的“Quick Cell支原体快速检测试剂盒（CAT:C4056L1060，价格：1250元/50次）”。

②多原理支原体检测策略

    市场在售的所有支原体检测试剂盒，目前没有一种可以检出全部可能的支原体污染，如果从事细胞治疗、进行干细胞培养、生产血清、胰酶、培养液工作的科研人员，强烈建议选择两种以上检测方法，确保支原体正确检出率达到100%，避免关键实验不必要的损失。

    细胞培养支原体污染是个普遍性问题，污染来源很多，根据国外生物实验室的规范做法，实验室的支原体检测要定期进行，一般一个月做一次支原体检测，可以第一时间确定支原体污染情况，显著降低或避免支原体污染对细胞培养相关实验的影响。

四、  支原体污染去除

1.     支原体污染预防

    根据可能的支原体污染来源，在体外细胞培养过程中，要严格控制环境污染；严格实验操作；细胞培养基和实验器材、耗材要保证无菌；在不影响实验结果的前提下，可在细胞培养基中加入适量的特定抗生素；发现支原体污染后，要清除支原体，防微杜渐。

2.     支原体污染的去除及预防

    因为支原体没有细胞壁，一般用于细胞壁合成的抗生素对支原体没有作用，如青霉素、万古霉素多粘菌素（polymycin）、利福平、磺胺药物普遍没什么效果。对支原体最有抑制活性及常用于支原体去除的抗生素是四环素类、大环内酯类及一些氟喹诺酮。在低浓度时，这些抗生素不会产生耐药性，且对哺乳动物细胞的毒性较小。四环素和大环内酯能结合30S和50S核糖体亚基，从而抑制支原体蛋白质合成，喹诺酮抑制DNA旋转酶。因此可以在细菌DNA复制及蛋白质合成两个层面上抑制细菌生长，明显增强除菌效果。

3.      支原体去除试剂选择

    选择支原体去除试剂需要注意几个关键几点： ①细胞毒性小，毒性大的试剂在去除支原体的同时，会杀死细胞；  ②支原体去除效果，选择广谱试剂，去除多种支原体，以及细菌，真菌等； ③操作简便，没有二次污染；要考虑操作使用是否方便，因为如果使用起来比较麻烦，首先是费时费力，另外可能会带来二次污染。目前市场上有多种支原体去除&预防试剂可选。包括李记生物的Quick Cell支原体预防/去除试剂，美国GenDEPOT公司的Cellmaxin，罗氏公司的BM-Cyclin，Biolnd的BIOMYC-1,BIOMYC-2,BIOMYC-3，以及Invivogen 公司的Plasmocin™ prophylactic和Plasmocin™ treatment 等。Quick Cell支原体预防及去除试剂和Cellmaxin都是从蛋白和DNA两个层面去除支原体，抗菌谱广。不同在于Quick Cell的使用者可以灵活选择单独或联合使用两种成分，分别或同时在蛋白或DNA层面去除支原体污染，细胞毒性更小。作用周期1-2周，支原体去除率大于92%。去除预防兼顾BM-Cyclin包含泰妙菌素（BM-Cyclin 1）和二甲胺四环素（BM-Cyclin 2）两种成分，抑制支原体及细菌生长，高效去除培养细胞中已感染的支原体。适用于多种培养细胞，无明显副作用，又不影响细胞本身的代谢，而且处理过的细胞不会重新感染支原体。BM-Cyclin需联合使用，作用周期2周，可消除80%以上的支原体。不确定能否预防。BIOMYC-1基于抗生素泰妙菌素，由真菌pleurotus mutilus 产生。 BIOMYC-2基于二甲胺四环素，四环素衍生物。此两种抗生素溶液通常按先后联合使用2－3次循环约一周以上，可取得良好的效果。BIOMYC-3 基于抗生素环丙沙星，属于氟喹酮类。许多支原体被证明对BIOMYC-3敏感，需要根据支原体种类使用。处理周期2周，能去除90%的支原体。是否可以预防支原体目前还不能确定。Plasmocin™ prophylactic和Plasmocin™ treatment也是两种抗生素的混合物，包含两个针对支原体的有效成分，作用于蛋白质合成和DNA复制阶段，对许多细菌和真核细胞则没有影响。作用周期2周，去除效率未知。有两个浓度包装，去除用高浓度，预防用低浓度。