Step1:蛋白表达

(1) 密码子优化+基因模板合成+表达载体构建；

(2) 质粒抽提+转染（哺乳表达系统）目的蛋白检测（WB，SDS-PAGE）；

(3) 蛋白表达放大+蛋白亲和纯化；

交付：表达载体，克隆甘油菌，重组蛋白3-3.5mg，纯度>85%，标准实验报告

4-6周

Step2:动物免疫

(1) 动物免疫4次，加强免疫一针，共计免疫5针；

(2) 免疫前采集阴性血清，第4针采血进行ELISA检测血清效价；

(3) 若第4针血清抗体效价（蛋白抗原>10⁵；多肽抗原>10⁴）满足要求，则采血前7天再次加强免疫1针，如不满足要求，则继续常规免疫；

(4) 效价合格，采血分离单核细胞；

动物：背景清晰（年龄，性别，防疫情况）；

免疫：蛋白抗原>10⁵；多肽抗原>10⁴；

采血：数量100ml以上；

PBMC细胞：>10⁵/vial

8-10周

Step3:模板cDNA制备

(1) PBMC总RNA提取（RNA提取试剂盒）

(2) 高保真RT-PCR制备cDNA（反转录试剂盒）

cDNA：反转后>1ug/ul，胶图分布均匀；

cDNA模板总量>150ug；

1 天

Step4:抗体酵母展示文库构建

(1) 以cDNA为模板，两轮PCR扩增VHH基因

酵母表达质粒构建与转化： VHH基因拼接酵母展示载体，电击转化酵母宿主菌，构建抗体库，电击次数不低于10次

鉴定：随机挑选24个克隆，PCR鉴定阳性率+PCR鉴定多样性+插入率

文库阳性率：>90%；

文库插入性率：>90%；

库容：>10⁶

1-2周

Step5:文库筛选（磁珠+Facs）

(1) 磁珠分选；

(2) FACS分选（免疫双标分选）；

(3) 铺板+阳性克隆菌培养+抗体基因测序；（>20个，多达96个）；

阳性标准：双阳性菌株；

VHH筛选标准：CDR氨基酸序列不同

2-3周

Step6:抗体验证（体外验证）

(1) 将获得的抗体序列构建合适的表达载体进行表达+亲和纯化+抗体蛋白定量；

(2) Elisa验证抗体与抗原结合，进行下游验证（交付EC50数据）;

(3) BLI法验证抗体亲和力；

(4) 细胞功能验证：流式验证；

(5) 验证细胞系（抗原受体过表达细胞系）；

交付：表达载体，克隆菌株，表达菌株，重组抗体蛋白1mg，纯度90%；

快速亲和力测定结果；

4-6周