活细胞或死细胞活性测定

用于定义细胞活力的参数，例如细胞膜完整性、线粒体膜电位和细胞内脂酶活性，可以共同用于区分活细胞和死细胞群，确定细胞活力，并筛选化合物的细胞毒性。这些参数构成了一些策略的基础，例如我们的Live or Dead细胞活性检测试剂盒，该试剂盒结合了两种荧光探针：活细胞脂酶底物和细胞不可渗透的DNA结合染料，以在样品中实现两种颜色的活细胞和死细胞区分。Live or Dead 检测可用于通过荧光显微镜、流式细胞仪或荧光测定法检查真核细胞和细菌。

Live or Dead细胞活性测定原理

AAT Bioquest的 Live or Dead细胞活性检测试剂盒是基于使用两种荧光探针同时测定活细胞和死细胞。活细胞的标记使用酮酸酯（Acetoxymethyl，AM）衍生物的草铵绿（calcein）或线粒体膜电位探针，而死细胞的标记使用细胞不可渗透的DNA结合染料。酮酸酯衍生物是非荧光脂酶底物，很容易扩散穿过完整的细胞膜并渗透到活细胞中。一旦进入细胞，非特异性细胞内脂酶将底物水解为荧光产物，将其固定在细胞内。底物发出的荧光信号是活细胞具有脂酶活性和完整膜的指示器。另外，线粒体膜电位探针也可用于区分活细胞。这些可渗透膜的阳离子染料被 passively 沿着细胞膜扩散，并在健康细胞的线粒体内积累，产生显著的荧光信号。相反，失去线粒体膜电位的死细胞将排除该染料，并且不会观察到信号。这种细胞不可渗透的DNA结合染料选择性的与DNA结合，具有高亲和力，只能穿透死细胞受损的膜，并在与核酸结合后会发出明显的荧光。然而，具有完整细胞膜的健康活细胞将阻止该染料进入细胞，从而产生负信号。由于细胞活性的测定取决于这些物理特性，不影响这些参数的细胞毒性事件可能无法准确地使用这些方法评估。

Live or Dead真核细胞检测

Live or Dead细胞活性检测试剂盒“红/绿双色荧光”

Live or Dead细胞活性检测试剂盒“红/绿双荧光”是一种快速简便的试剂盒，用于准确测定真核细胞中的细胞活力和细胞毒性。该试剂盒包含两种探针：CytoCalcein Green和碘化丙锭，可以同时添加到样品中，通过双荧光区分活细胞和死细胞，而无需任何洗涤步骤。CytoCalcein Green是一种荧光脂酶底物，可以用绿色荧光标记具有脂酶活性的活细胞，同时，碘化丙锭是一种不可渗透细胞膜的核酸染料，可以用红色荧光标记死细胞。该试剂盒可以轻易适用于各种荧光平台的高通量测定，包括荧光酶标仪，成像系统和流式细胞仪，并且与3D细胞培养模型、球体、贴壁细胞、非贴壁细胞和某些组织兼容。与其他评估细胞活力的替代方法（如台盼蓝排除实验或铬释放实验）相比，相比，Live or Dea 细胞活性检测试剂盒在定义细胞毒性事件方面更安全、更经济、更敏感。

图1.活细胞或死细胞活性的影像学检测。用Live或Dead细胞活性检测试剂盒分析90%活细胞，0%固定细胞和两个细胞的混合物（活/固定=50/50），并用荧光显微镜在FITC和TRITC通道中成像。

Live or Dead细胞活性检测试剂盒“红/绿双色荧光”优点：

1. 对活细胞和死细胞进行稳定且有选择性的双荧光染色；

2. 该试剂盒采用快速简单的一步染色程序，可以同时添加两种探针；

3. 无需洗涤使其非常适合高通量筛选应用；

4. 该试剂盒可通过荧光显微镜、流式细胞术和荧光酶标仪检测；

5. 适用于贴壁和非贴壁细胞。

Live or Dead细胞活性检测试剂盒“红/蓝双色荧光”

Live or Dead细胞活性检测试剂盒“红/蓝双色荧光”是一种方便的试剂盒，基于细胞膜完整性和线粒体膜电位活性来确定细胞活力和细胞毒性。该试剂盒具有两种探针Cellbrite^TM Red和Nuclear Blue^TM DCS1,可以同时添加到样品中，用于活细胞和死细胞的双色荧光测定。ellbrite^TM Red能够将具有活跃线粒体的活细胞染成红色，而不可渗透膜的DNA染料Nuclear Blue^TM DCS1将死细胞染成蓝色。该试剂盒可以轻松适用于多种荧光平台的高通量分析，如荧光酶标仪分析，免疫细胞化学，成像与流式细胞术，并且与3D细胞培养模型、球体、贴壁细胞和非贴壁细胞兼容。

图2.Live or Dead 细胞活力检测试剂盒（双荧光）（Cat#22788）标记的HeLa细胞的荧光图像。HeLa细胞以每孔100,000个细胞/100 µL的密度在96孔黑壁/透明底板上过夜培养。细胞在37°C下用0-1 µM的staurosporine（SS）处理4小时（A-D），或者用乙醇固定（E），然后与染料加载溶液孵育1小时。分别使用Texas Red或Cy5滤光片测量活细胞（红色）和死亡细胞（蓝色）的荧光信号。相应的荧光信号使用FlexStation®荧光酶标仪（Molecular Devices）在底部读取模式下进行测量，波长分别为Ex/Em = 610/650（Cutoff=630 nm，红色）和Ex/Em = 360/450（cutoff=420 nm，蓝色）。

表1.真核细胞Live or Dead 细胞活性测定选择指南

1. FC=流式细胞术 FM=荧光显微镜 MA=微孔板测定

Live or Dead细菌检测

MycoLight荧光活/死细菌成像试剂盒

MycoLight荧光活/死细菌成像试剂盒提供了一种快速简便的方法来区分悬浮或固定在滤膜上的活细菌或死细菌。该试剂盒包含两种探针：MycoLight520和碘化丙锭，可以同时添加到细菌样品中，无需任何洗涤步骤，非常适合高通量筛选。MycoLight520是一种能穿透细菌质膜的荧光酯酶底物，能够通过被动扩散进入细菌的质膜，并将活细菌染成绿色。相反，碘化丙锭只能渗透受损的细菌膜，将死细菌标记为红色荧光。因此，通过适当混合MycoLight™ 520和碘化丙锭染料，具有完整细胞膜的活细菌发出绿色荧光，并使用标准荧光素滤光片进行分析，而受损细胞膜的死细菌发出红色荧光，并使用标准TRITC滤光片进行分析。

图3.用MycoLight 荧光活/死细菌成像试剂盒染色活的和死的枯草芽孢杆菌的混合群体。 具有活性细胞内酯酶的活细菌显示绿色荧光，而70%酒精杀死的细胞膜受损的死细胞则显示红色荧光。

表二.MycoLight荧光活/死细菌成像试剂盒

Live or Dead流式细胞术固定分析

能够区分和排除死细胞的能力，实现了对细胞群体的清晰分离和鉴定，这大大提高了实验的准确性，消除了各种试剂与死细胞的非特异性结合所引起的不良伪影和假阳性。为了从流式细胞仪读数中区分活细胞和死细胞群体，AAT Bioquest提供了多种Live or Dead可固定性死细胞染色试剂盒。标记稳定、高效，并且与固定剂和渗透缓冲液兼容，从而可以进一步分析细胞内靶标。

Live or Dead固定化死细胞标记试剂盒

使用无法穿透细胞膜的胺基反应性染料，在流式细胞仪中区分活细胞和死细胞。每个试剂盒提供的染料可以轻松渗透受损的死细胞膜，并共价结合到细胞内外的含有胺基的蛋白质上，产生强烈的荧光信号。而在活细胞上，荧光信号微弱，因为细胞表面的胺基仅可与染料反应。活细胞和死细胞群体之间信号强度的差异明显，因此很容易将死细胞排除在分析之外。使用Live or Dead固定化死细胞标记试剂盒的标记的细胞可以被固定、渗透化处理，并用于细胞内免疫表型分析或其他多参数染色实验。AAT Bioquest提供多种Live or Dead固定化死细胞标记试剂盒，设计用于有效激发主要的激发源，包括350、405、488、532、561、633和647 nm激光线，并在常见通道发射。这些试剂盒是保存特定细胞的荧光图像的优秀工具，也可用于荧光显微镜演示。

表三.用于流式细胞术的Live or Dead固定化死细胞标记试剂盒