移植NEP基因转染的神经干细胞对AD大鼠行为学的影响

移植NEP基因转染的神经干细胞对AD大鼠行为学的影响

阿尔茨海默病(Alzheimer disease ，AD)病理过程的关键问题是患者脑中p一淀粉样多肽的异常增加和沉积。中性内肤酶( NEP)是脑内最重要的A p降解酶，是影响脑内Ap分解代谢速率的限制因素。神经干细胞(neural stem cell ， NSC)是具有向多种细胞系分化又具有自我更新能力的细胞。NSC、治疗AD是运用其特性修复和替代受损的神经细胞，另外，NSCs是非常理想的基因载体，拥有许多其他载体所没有的优点。本实验将NEP基因转染的神经干细胞移植到AD大鼠侧脑室，观察行为学的变化，为阿尔茨海默病的治疗提供新的依据。

1材料和方法

1. 1实验动物

    清洁SD大鼠由佳木斯大学动物实验中心提供。

1.2主要试剂

胎牛血清、Ap1一40、神经干细胞基础培养基、神经干细胞完全培养基、神经小球分散试剂盒等均购于美国Sigma公司。

1.3方法

1.3.1动物模型的建立

选左侧海马CAI区为注射区:根据Pellegrino和Cusmhna的大鼠脑立体定位图谱，确定本研究中的注射坐标为前囱后3. 3mm，中线左侧2. 2mm，硬脑膜下2. 8mm。用微量加样器缓慢注射Ap一40溶液1 uL，之后缓慢撤针，充分消毒，缝合皮肤。术后常规饲养，待两周后做细胞移植。

3. 2分组和细胞移植

30只AD大鼠在随机分为3组，每组各10只:AD模型组、移植神经干细胞组(NSCs组)和移植NEP基因转染神经干细胞组(NEP一NSCs组)。选左侧海马C AI区在3组AD大鼠分别微量植入6},L细胞培养液、NSC悬液及NEP一NSC悬液(浓度约为1 x 105个细胞枢L)，注射完毕后，全层缝合头皮，腹腔注射青霉素，术后放置于温暖安静处至清醒。每组大鼠术后第8周进行实验。

1.3.3隐蔽平台实验

实验期限为6d。实验前让大鼠自由游泳1分。在水迷宫象限的中央固定隐蔽平台的位置，将每只大鼠头朝外壁在任何一个象限内的随机位置放入水中，大鼠爬到平台上或到达60秒时，实验立即停止。大鼠自己爬到平台或操作人员引导使其爬上平台后停留10秒。每天训练4次，每次间隔30min。通过影像系统记录大鼠寻找并爬上平台所需时间即逃避潜伏期。此实验用于测量动物在水迷宫中的学习和记忆能力。

1.3.4空间探索实验

第7天在水迷宫中撤除平台，将动物在任意一个入水点将放入水中，检测60秒时间内，大鼠出现在目标象限(target quadrant } TQ)的百分比。此实验用来检测动物保持记忆能力。

1.4统计学方法

采用SPSS 11. 3软件分析，各组间统计分析应用t检验。实验数据以表示。

2结果

2. 1行为学测试

与AD模型组相比，NEP一NSCs组和NSCs组的AD大鼠在第4,5,6天的平均潜伏期均明显缩短(P < 0. OS)，以NEP一NSCs组尤为明显，且NEP -NSCs组的AD大鼠在第4,5,6天的平均潜伏期亦明显比NSCs组缩短(P<0. 05)

2. 2空间探索实验

与AD模型组相比，NSCs组和NEP一NSCs组AD大鼠在目标象限探索时间的百分比有所增加，以NEP一NSCs组明显，但无统计学差异(P>0. 05 )。

3讨论

    本实验中Ap海马C AI区微量注射制备AD大鼠模型，将NEP基因转染的神经干细胞移植到AD模型大鼠侧脑室区，通过隐蔽平台获得实验和空间搜索实验评价NEP基因转染对AD大鼠学习记忆的影响。实验结果显示:隐蔽平台获得实验中，与AD模型组相比，NEP一NSCs组和NSCs组在第4,5,6天的平均潜伏期均明显缩短(P < 0. OS);与NSCs组相比，NEP一NSCs组第4,5,6天的平均潜伏期亦明显缩短(P<0. OS )。这表明NEP一NSCs  组和NSCs组均能显著改善AD大鼠的学习和记忆功能。空间探索实验中，与AD模型组相比，NEP -NSCs组和NSCs组在TQ象限搜索时间的百分比有所增加，但无统计学意义。水迷宫实验表明，海马移植了转染NEP基因的神经干细胞后，可以明显改善AD大鼠的学习和记忆功能，原因是由于海马移植了转染NEP基因的的神经干细胞后，可以高表达NEP蛋白，NEP蛋白是Ap降解酶，因此可以减少Ap在皮层及海马区的沉积，降低了Ap对神经系统的毒性作用。从而改善和提高了AD大鼠的学习和记忆功能。