免疫细胞

免疫细胞包括很多细胞：

先天免疫细胞：粒细胞（嗜碱性粒细胞、嗜酸性粒细胞和中性粒细胞），肥大细胞，单核细胞（发展成巨噬细胞），中性粒细胞，树突状细胞（DC是一种重要的抗原呈递细胞（APC），也可以由单核细胞发育而来），自然杀伤细胞(NK具有先天免疫和适应性免疫的双重特性，可以保留为记忆细胞）。

适应性免疫细胞：B细胞（有两个主要功能: ① 向T细胞提供抗原，② 产生抗体来中和感染性微生物。）T细胞（有多种作用，并按亚群分类。T细胞分为两大类: CD8+ T细胞或CD4+ T细胞）。

免疫细胞的收集

免疫细胞的收集通常说的是外周血单个核细胞（Peripheral Blood Mononuclear Cell, PBMC）的收集。正如名字所指出的，PBMC是指外周血中具有单个核的细胞，包括淋巴细胞（Lymphocytes）、单核细胞（Monocytes）、树突状细胞（DC）和其他少量细胞。

淋巴细胞包括B细胞、T细胞、NK细胞等细胞，占据PBMC细胞的大多数，也并没有发现很多将两者分开的文章和操作手册，因此在此我们只针对PBMC细胞的收集做一个概述。

PBMC存在于外周血中，可利用细胞分离技术从全血中分离出来。总的来说，PBMC只占全血样本的一小部分（约1%），当被其他物质挤在一起时，很难进行研究。三种最常见的PBMC分离方法包括：密度梯度离心、荧光活化细胞分选（FACS）、磁激活细胞分选(MACS)，每一种血液分离方法都有自己的优点和缺点。

密度梯度离心

密度梯度离心依靠物理特性，如大小和密度来分选细胞群。通过将样品放入高速旋转的离心机中，不同类型的细胞将通过与相似密度的颗粒分组来进行分类。密度较大的粒子会落到底部或外面，而密度较小的粒子会停留在中心或上升到顶部。对一个标准的全血样本进行离心，将分离出血液成分的一般层，集中在试管底部的红细胞(大约占总体积的45%)，中间层的灰白色涂层层——包含各种白细胞和血小板(大约占总体积的1%)，以及血浆——包含允许血液流动的水状液体，随着各种蛋白质和溶解的营养物质和气体(大约占总体积的55%)在管的顶部。

根据所用采血管含有的成分，密度梯度离心也有三种方法。

• 柠檬酸钠CPT管采血的细胞分离

柠檬酸钠是一种抗凝剂：柠檬酸根可与血液中的钙离子结合，生成可溶解性的络合物。由于钙离子在凝血过程中起到促进凝血作用，因此血液中的钙离子浓度下降会阻止血液的凝结。

步骤：

1. 室温(15℃~ 30℃)竖直存放血浆收集管，直到离心。

2. 离心前将试管轻轻倒转8 - 10次，使细胞重新混合。

3. 将离心管置于水平转子中，室温(15℃~30℃)，1800 x g (RCF)离心30分钟。转速必须仔细计算。降速过程中不要使用刹车。应注意确保CPT管是正确地安装在离心机中。

4. 在离心机完全停止后，小心地取出试管并放置在一个架子上。

5. 单个核细胞和血小板位于血浆层下方的白色层中(见图1)。

6. 在不干扰细胞层的情况下，从每根CPT管中抽取血浆层。如果方案要求收集血浆，请参阅方案的具体文件。

7. 用移液管从每个试管中收集单个核细胞层，并将其转移到50mL带帽的塑料锥形离心管。

8. 如果收集3根或更少(≤3根)CPT管，将全部CPT管收集到的细胞层放入一个50mL离心管。

9. 如果收集的CPT管多于3根(>3)，则取其中2 - 3根CPT管的细胞层放入一个50mL离心管。不要将三个以上CPT管的细胞层组合在一起放入一个50mL离心管。重复此步骤，直到将所有CPT管的细胞层转移到50mL离心管中，然后进行洗涤步骤。

图1 CPT管离心结果

• 带有预填充 Frit 屏障的ACD、NaHep或EDTA管采集血液的细胞分离

在加入血液之前，目视检查CSTFB，看是否有液体在 Frit上面。如果 Frit上面有液体，将CSTFB在1000 x g下离心30秒。如果有密度梯度离心后溶液仍在 Frit上方，应吸除。

步骤：

1. 血液稀释用于CSTFB分离

血液与生理盐水的最大比例约为2:1。每10 ~ 20mL全血使用一个50mL管(或每5 ~ 10mL全血用一个12 ~ 14mL管)。按要求使用尽可能多的CSTFB来分配每个样品的所有血液。

(1) 在每个CSTFB上标上样品识别号。

(2) 用无菌吸管向每个CSTFB中加入生理盐水溶液：50mL CSTFB管加5mL生理盐水。

(3) 轻轻混合全血，然后用无菌移液器将血液转移到标记的CSTFB中。

(4) 使用无菌移液器，用生理盐水冲洗每个原始抗凝血管并转移溶液冲洗量到CSTFB，确保不超过总管体积(生理盐水+全血)的限制：50mL管的总体积不应超过30mL。

(5) 小心盖上CSTFB。

2. CSTFB密度离心和PBMC收集

(1) 保持试管直立，轻轻转移到离心机上。

(2) 800 ~ 1000 x g, 15℃~ 30℃离心15分钟，关闭刹车。(一些样品在1000g离心PBMC分离的效果可以改善。如果降速过程中存在刹车，就会破坏分层。)

(3) 离心时，准备新无菌离心管；这将与上一步中使用的管子数量相同。用样品识别号标记每个试管。

(4) 轻轻将CSTFB从离心机中取出，以免扰乱各层。

(5) 离心使试管（包括 Frit层）的内容物分成六个不同的层。

(6) 检查管里是否有以下可能的问题。根据实验室要求记录观察结果和采取的后续行动。

①、血浆+生理盐水溶液层。

②、离心后在 Frit上可见凝块。

③、由于离心速度，时间或制动错误，PBMC层较差。PBMC层小而模糊，血浆+生理盐水层可能略有混浊。

④、由于红细胞计数或红细胞比容低，在 Frit上形成PBMC层。

(7) 每个样品使用新的无菌移液管去除上层淡黄色血浆+盐水溶液的组分，至云状白色PBMC带（位于血浆+盐溶液层界面和透明分离介质溶液间）的上方约1~2厘米的位置。根据实验室政策，丢弃血浆+生理盐水溶液的组分。（或者，上层血浆+盐水溶液部分可以保留。而浑浊的白色PBMC带可通过上层小心插入移液器移至PBMC带。）

(8) 使用无菌血清学移液器收集上述PBMC带处的所有细胞。注意不要吸入多于必要的分离介质溶液。

(9) 将收集到的细胞从一个CSTFB转移到一个相应的、预标记的无菌离心管。管子可以预先添加盐水溶液以节省时间（50mL管加25mL生理盐水溶液）。之后进行洗涤步骤。

(10) 将含有剩余的红细胞和分离介质CSTFB重新盖上盖子。按照实验室政策，将CSTFB作为生物危害废物丢弃。

图2 pre-filled Frit Barrier管离心结果

• 手动密度梯度介质覆盖或衬底分离细胞 （Ficoll分离）

分离单核细胞常使用Ficoll作为分离液的主要成分，Ficoll是蔗糖的多聚体，呈中性，平均分子量为400000，当密度为1.2g/ml时也未超出正常生理性渗透压，也不穿过生物膜。

通过Ficoll密度梯度离心，红细胞、粒细胞比重大于分离液比重，离心后沉于管底；淋巴细胞和单核细胞的比重小于或等于分离液，离心后漂浮于分离液的液面上，也可有少部分细胞悬浮在分离液中。吸取分离液液面上的细胞，就可从外周血中分离到单核细胞，并进行之后的培养与检测。

步骤：

1. 血液稀释

(1) 打开抗凝血管的盖子。

(2) 在每根离心管上标上样品识别号（50mL管加12 ~ 22mL血，15mL管加4至5mL血）。

(3) 将血液移入无菌、有标记的15或50mL离心管中，根据制备密度梯度的试剂盒说明加入足够的生理盐水来稀释血液（血液与稀释液的最大比例应为2:1）。

2. 密度梯度细胞分离

（两种方法：（1）覆盖overlay，先制备梯度在加样品；（2）衬底underlay，先加样品再加梯度。加完后盖好盖子。）

3. 淋巴细胞密度离心和PBMC收集

(1) 保持试管直立，轻轻地转移到离心机。

(2) 按照说明书概述，在15~30°C条件下，400 x g离心30分钟，关闭制动器。（如果降速过程中存在制动会破坏分离层。离心机制动器必须关闭以使分离干净，并最大限度地回收pbmc。）

(3) 离心使管内内容物分成四层。

图3 ficoll密度梯度离心结果

(4) 在离心管进行离心时，准备新的无菌离心管。这将与上一步骤中使用的管子数量相同。用样品识别号标记每个试管。

(5) 离心完成后从离心机上取下离心管。

(6) 如果看不到细胞层，确认离心机运转正常。纠正你发现的任何问题。重新离心试管。记录问题和在研究记录中采取的行动。

①、如果再离心后细胞层仍然不可见，记录，移除和丢弃盐溶液上清，然后继续。

②、如果血浆层非常浑浊，可能很难看到血浆层与密度梯度介质的界面。用10mL移液管除去界面上方的大部分血浆可改善淋巴细胞的收集，例如只留下0.5厘米的血浆层。为了收集细胞要求更好地定位移液器的尖端。

(7) 每份样品使用新的无菌移液器，去除上层黄色血浆+生理盐水溶液的组分，至浑浊白色PBMC带的上方大约1~2cm的位置（位于血浆+生理盐水溶液淡黄色组分和密度梯度分离介质溶液间）。按实验室政策丢弃血浆+生理盐水溶液的组分。（或者，上层血浆+盐水溶液部分可以保留。而浑浊的白色PBMC带可通过上层小心插入移液器移至PBMC带。）

(8) 使用无菌移液管，在PBMC带（浊白处）收集所有细胞。注意不要吸入更多的分离介质溶液。

(9) 将收集到的细胞从一个锥形离心管转移到另一个相应的、预标记的无菌离心管。离心管可以预先填充生理盐水以节省时间。之后进行洗涤。

4. 重新盖上装有剩余红细胞/分离物的锥形离心管。按照实验室政策，将试管作为生物危害废物进行培养基和丢弃。

流式细胞术

涉及到流式细胞仪的使用的一种免疫细胞分离技术，流式细胞仪是一种根据大小、形状和荧光亮度等特征标记不同颗粒的仪器。这种方法被称为荧光激活细胞分选(FACS)，它允许样品流过一个管子，然后将成分分成不同的组。

FACS需要昂贵的设备和受过适当训练的人员。这种技术在分选需要许多不同群体的不同细胞样本时很有用，但使用这种方法分离白细胞非常耗时。通常，在使用流式细胞术处理之前，样品应首先进行“制备”或清理，以分离原始样品内容物的特定子集，这可以减少细胞分选所需的时间，因为机器将处理更小、更浓缩的样品量。这样还可以产生更多健康的、有活力的细胞，因为当处理时间大大减少时，自然细胞死亡就会减少。

Magnetic-activated cell sorting (MACS) 磁激活细胞分选

另一种方法是将磁珠与靶细胞结合，并使样品通过磁场，使附着磁铁的细胞悬浮。磁激活细胞分选(MACS)比前面提到的两种方法更快、更便宜，但它的细胞损失是三种方法中最高的。强烈的磁场会使细胞破裂、细胞器破裂、使样品混乱。这种细胞外碎片可引起结块和阻塞，从而导致较低的吞吐量。

随着科技和技术的不断进步，相信会有更好的免疫细胞分离技术不断涌现，我们也会继续关注相关发展，以便为顾客提供更好的服务。

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