郑州博赛生物抗体中心抗体制备实验流程

 郑州博赛生物抗体中心抗体制备实验流程（仅供参考）

一、鼠源性单克隆抗体（McAb）制备实验流程

1.免疫动物：3-5只Balb/c小鼠

2.佐剂：首先用完全弗氏佐剂（CFA），后用不完全弗氏佐剂（IFA）。

3.免疫原：蛋白或KLH偶联多肽。每次免疫使用50-100μg免疫原。

4.免疫：用PBS稀释免疫原，然后与相应的佐剂1：1混合。抗原和佐剂完全混合形成稳定的乳剂，将该乳剂在小鼠双肩周围的皮肤下进行皮下注射和后腿进行肌肉注射。每个区域大约用1/8的免疫原。接着将1/2的免疫原进行腹腔注射，这样免疫原可以持久存在从而提高免疫应答。以后每个星期进行腹腔注射直到达到要求的效价。

5. 第0星期预采血
　　 完全弗氏佐剂（CFA）混合的100μg抗原免疫小鼠。
　  第2星期
　　 不完全弗氏佐剂（IFA）混合的50μg抗原免疫小鼠。
　  第3星期
　　 不完全弗氏佐剂（IFA）混合的50μg抗原免疫小鼠。
　  第4星期
　　 溶解在PBS中的50μg抗原免疫小鼠。
　  第5星期
　　 取适当的细胞或组织进行ELISA和WB检测，
　　 溶解在PBS中的50μg抗原免疫小鼠。
　  第X星期
　　 取适当的细胞或组织进行ELISA和WB检测，
　　 溶解在PBS中的50μg抗原免疫小鼠。

6.杂交瘤融合和筛选：用PEG方法将效价最好的小鼠脾细胞和骨髓瘤细胞进行融合。用抗原对融合的杂交瘤克隆进行筛选，检测它们的特异性和敏感性。ELISA阳性的克隆可用WB检测，筛选出来的克隆至少还需要亚克隆两次。

7.大规模抗体生产：筛选得到的克隆最后进行大规模培养或者取腹水（每个克隆5只小鼠）。用蛋白A/G对培养液或腹水进行纯化，平均每个克隆可以得到3-5mg 抗体。

8.注意：每个融合平均可以得到数百个克隆，对于多肽抗原可以得到100个左右的ELISA阳性克隆，重组蛋白抗原可以得到100-150个ELISA阳性克隆。亚克隆实验做的越早，越容易保存克隆。因此，为了保存和复苏阳性克隆，尽早进行筛选检测是必需的。

二、多克隆抗体（PcAb）制备实验流程

1.免疫动物：两只新西兰兔

2.佐剂：首先用完全弗氏佐剂（CFA），后用不完全弗氏佐剂（IFA）。

3.免疫原：蛋白或KLH偶联的多肽。每次免疫100-200μg免疫原。

4.免疫：用生理盐水稀释免疫原，然后与相应的佐剂进行1：1混合。抗原和佐剂完全混合形成稳定的乳剂，将该乳剂在兔子双肩周围的皮肤下进行皮下注射和后大腿进行肌肉注射。每个区域大约用1/4的免疫原。这样免疫原可以持久存在从而提高免疫应答。

5. 取血：用19号针头对兔子进行耳动脉取血，室温过夜析出血清。

第0星期 采血2ml（获得0.5-1ml免疫前血清）
　　 完全弗氏佐剂（CFA）混合的200μg抗原免疫兔。
　 第2星期
　　 不完全弗氏佐剂（IFA）混合的200μg抗原免疫兔。
　 第4星期
　　 不完全弗氏佐剂（IFA）混合的100μg抗原免疫兔。
　 第5星期
　　 取检测血清20-30ml
　　 取适当的细胞或组织进行ELISA和WB检测，
　　 溶解在生理盐水中的100μg抗原免疫兔。
　 第6星期
　　 如果检测阳性第一次采血20-30ml，
　　 溶解在生理盐水中的100μg抗原免疫兔；
　　 如果上次检测是阴性，取适当的细胞或组织进行ELISA和WB检测。
　 第7星期
　　 第二次采血20-30ml，
　　 溶解在生理盐水中的100μg抗原免疫兔；
　　 如果检测仍为阴性，需要讨论这个项目是否继续。
　 第8星期
　　 第三次采血20-30ml，
　　 溶解在生理盐水中的100μg抗原免疫兔。
　 第9星期
　　 末次放血20-30ml，
　　 纯化混合血样，平均每次纯化可以获得100-150mg抗体，最后进行ELISA和WB等质量检测。

6. 注意：在整个项目中，兔子需要保持9周的免疫和放血。检测的结果将决定这个项目的继续、修改或终止。应客户要求，可以延长免疫继续采血，但需另外付费。

如您有单抗、多抗定制方面的需求，请垂询博赛生物抗体中心及博赛营销中心！

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