甲型H1N1流感病毒的MDCK细胞分离方法

附件7
甲型H1N1流感病毒的MDCK细胞分离方法

一、目的
流感病毒的MDCK细胞分离方法是流感实验的关键技术，用于流感病毒的分离、培养。本SOP是为确保MDCK细胞分离甲型H1N1病毒的操作准确、规范和可靠而制定。
二、程序
（一）生物安全要求
甲型H1N1病毒的MDCK细胞分离培养实验室生物安全级别：BSL-3。实验操作人员需进行BSL-3防护。甲型H1N1病毒的MDCK细胞分离操作必须在BSL-3级实验室的生物安全柜中进行。
（二）材料
1、75％～90％成片的MDCK细胞，选用合适大小的细胞培养瓶和细胞培养板来用做病毒分离
2、TPCK处理胰酶（牛胰腺来源Ⅷ型）
3、HEPES缓冲液，1M母液 （GIBCO Cat No 15630）
4、D-MEM培养基（高糖含有L-谷氨酰胺 GIBCO Cat No 11965），Hank's液(病毒所配液室配制)
5、青、链霉素母液（10000 U/mL 青霉素G；10000 µg/mL硫酸链霉素 （GIBCO Cat No 15140）
6、牛血清白蛋白组分Ⅴ，7.5%溶液（GIBCO Cat No 15620）
7、临床样品0.5mL
8、1mL无菌移液管
9、10mL无菌移液管
10、15mL无菌离心管
（三）实验步骤
1、准备病毒生长液
1）细胞维持液准备
500mL D-MEM液中加入下列试剂：
（1）青、链霉素母液5mL（终浓度达：100U/mL 青霉素；100µg/mL链霉素）
（2）牛血清白蛋白组分Ⅴ 12.5mL（终浓度：0.2%）
（3）HEPES缓冲液12.5mL（终浓度：25mM）
2）病毒生长液
每500mL细胞维持液中加入0.5mL的TPCK-胰酶（母液浓度为2mg/mL）使TPCK-胰酶的终浓度为2µg/mL。
2、甲型H1N1病毒MDCK细胞分离步骤
1）75％～90％成片细胞的准备，以选取T25细胞瓶为例。
①用40×物镜观察细胞生长状态。
②轻轻倒出细胞生长液，用10 mL 的无菌移液管吸取6mL Hank's液分别清洗细胞3遍。
2）细胞培养瓶的接种
（1）用无菌的移液管将清洗细胞的Hank's液从细胞培养瓶中移出。
（2）用无菌的移液管吸取适量临床标本置于细胞培养瓶中，温和摇动数次。
（3）然后放于37℃ 5% CO2培养箱中吸附1～2h。
（4）吸出接种物，用10 mL 的无菌移液管吸取6mL Hank's液分别清洗细胞2遍。然后加入6mL病毒生长液于细胞培养瓶中。
（5）放置于33～35℃培养箱培养。
（6）每日观察细胞病变情况。（细胞病变的特征是细胞肿胀圆化，细胞间隙增大，细胞核固缩或破裂，严重时细胞部分或全部脱落）。
3、细胞培养物的收获
1）当75%～100%细胞出现病变时进行收获，收获之前可以将细胞放于-70℃冰箱，冻融1～2次，以提高收获标本的病毒滴度。即使无细胞病变也应该于接种后第7天收获。收获病毒液时，先温和摇动细胞瓶数次，然后用10mL的无菌移液管吸取病毒液置于15mL无菌离心管中，混匀病毒。
2）收获的病毒液可以进行红细胞凝集实验，如没有红细胞凝集现象，应将收获病毒培养液再MDCK细胞传代2-3次。
3）如果有必要，可再通过血凝抑制实验鉴定分离物，并将分离物保存在-70℃或-70℃以下。