实验十 呼吸道感染的病毒学检查

实验十 呼吸道感染的病毒学检查
（the Virological Examination of Respiratory Tract Infection）

        呼吸道病毒是指主要以呼吸道为传播途径，侵犯呼吸道粘膜上皮细胞，并引起呼吸道局部感染或呼吸道以外组织器官病变的一类病毒。主要包括流感病毒、麻疹病毒、腮腺炎病毒、副流感病毒、呼吸道合胞病毒、鼻病毒、冠状病毒等。90%以上的急性呼吸道感染由病毒引起。对于呼吸道病毒的检测方法主要包括病毒分离培养、血清学诊断和PCR等快速诊断方法。

流感病毒的分离与鉴定

【目的要求】
1． 熟悉病毒严格细胞内寄生的特性。
2． 了解流感病毒的分离、培养与鉴定过程。
3． 掌握病毒血凝、血抑试验的反应原理及用途，熟悉其结果判断。

【临床资料】
女性，24岁， 患者于2天前受凉后出现咽痛，伴鼻塞、流涕、全身乏力。当日夜间出现畏寒，头痛，无咳嗽咳痰。查体：患者精神不振，咽部红，双侧扁桃体无明显肿大，未见化脓灶。T：38.5℃，余正常。实验室检查：血WBC 5.0×109/L，其中淋巴细胞70%。在家口服“阿莫西林”，症状无减轻。给予“安乃近”退热、“病毒唑”抗病毒、“地塞米松”抗炎，并嘱注意休息。次日热退，咽痛减轻。2天后无咽痛。
问题：
1． 最有可能引起本病的是哪类病原体？
2． 用哪些方法可以检测出这类病原体？

【流感病毒分离与鉴定程序】
                                          可疑病人感染急性期含漱液（双抗处理）
                 ↓                            ↓
                      9~11日龄鸡胚（33~35℃）                    原代猴肾细胞等（33~35℃）
                 ↓                            ↓
                                        3天                                                               7~10天

                                      ↓                             ↓

                              收获羊水或尿液                                              有、无细胞病变

                 ↓                             ↓

     用鸡、豚鼠或鸡和豚鼠混合红细胞做血凝试验           用豚鼠红细胞做血细胞吸附试验

          ↓                                         ↓                                   ↓                                     ↓

          阳性                                         阴性                                  阳性                                 阴性

    ↓

   用血凝抑制试验或补体结合试验鉴定病毒型或亚型
 

一、流感病毒鸡胚尿囊腔接种及尿囊液收集方法

病毒具有严格细胞内寄生性，必须提供活的机体、组织或细胞才能使其增殖。常用的培养方法有动物接种、鸡胚培养及组织细胞培养等。
鸡胚培养方法操作简便，适用于流感病毒、痘病毒、疱疹病毒和脑炎病毒等的培养。鸡胚培养的接种方法有很多，最常用的有：绒毛尿囊膜接种法、羊膜腔接种法、尿囊腔接种法和卵黄囊接种法。可根据病毒的特性，选择适宜的接种途径。流感病毒初次分离一般采用鸡胚羊膜腔或尿囊腔接种法。

鸡胚接种方法

A、鸡胚的观察（示教）
鸡胚是培养病毒及立克次体最易得的活细胞材料，受精卵一般经21天的孵育即可发育成小鸡，用于接种培养的一般为6~12天的鸡胚，了解鸡胚的结构是进行鸡胚接种的基础。
【材料】
来抗鸡受精卵，其特点是个大、壳薄、色浅而易于在检卵灯下检视。
【方法】
手持鸡蛋放入检卵灯的检卵孔上，缓慢地将鸡蛋翻动，从各个方向注意观察鸡胚的结构。
1．孵育前：于检卵灯上检查鸡蛋是否受精。将受精卵用清水刷干净，用干布拭干，放入孵育箱中孵育，控制温度为38~39℃，相对温度为45~60%。
2．孵育三天后，每天翻动鸡蛋1~2次。
3．孵育后第4天，于检孵灯下检视，淘汰死胚，留下活胚：
活胚胎——血管清晰，可见鸡胚显影及胚动。
死鸡胚——血管模糊昏暗，胚动呆滞或不动。
未受精卵——不见鸡胚痕迹。
4．孵育后第6~12天检视：
根据上述观察到的活鸡胚，继续孵育6~12天再进行观察及接种，这时观察注意气室、鸡胚及其他部分的相对位置，用铅笔将气室及鸡胚的位置画出。
鸡胚的结构 （见图10-1）从内部到外分为鸡胚、羊水腔、卵黄囊、尿囊腔、气室等部分构成，每一部分都有膜的结构将其他部分隔开，羊水腔内充满保护鸡胚生长发育的液体，一般随鸡胚发育而扩大；卵黄囊内贮备供鸡胚生长发育用的营养物质，随鸡胚生长发育，营养消耗而逐渐缩小；尿囊腔是鸡胚代谢产物的贮存室。

B、鸡胚的接种（见图10-1）

1、鸡胚尿囊腔接种方法
【材料】
1．鸡胚（已孵育9~11天）
2．疑为流感病人的嗽液
3．1ml注射器、5号针头、液体石蜡（以上均已灭菌）、胶布、钻子、镊子
【方法】
1．孵育9~11天的鸡胚，置检卵灯上检视，划出气室及胚胎位置，同时在尿囊与气室交界边缘上约1~2cm处作一标记。
2．用碘酒消毒标记部位，用消毒针钻孔，仅破蛋壳，勿穿卵膜。
3．将鸡胚直立于卵架上，注射器垂直经气室而穿入1cm即达尿囊腔，注射流感病人嗽液0.2ml。
4．接种后，用熔化石蜡封此小孔，放入37℃培养40~48h可收集。流感病毒培养一般孵育40~48h即可收获。24h内死亡者为非特异性死亡，弃去。
5．解剖及收获。收获前应先将鸡胚放于4℃冰箱过夜使其血液凝固，以免解剖时出血过多。将鸡胚直立于卵架上，消毒气室部位卵壳，用无菌镊子将壳剥去，另用一无菌镊撕开壳膜及绒毛尿囊膜，用无菌毛细管吸取尿囊液，约可得5~6ml。

2、卵黄囊接种法
【方法】
1．取孵育6~8天的鸡胚，灯检画出气室。
2．将卵置卵架上，气室向上，用碘酒、酒精消毒气室部的卵壳。
3．用无菌锥在气室中心钻一小孔，注射器由气室小孔向胚胎位置相反方向，沿卵中
轴做20~30度角倾斜刺入3cm，即达卵黄囊内，注入待检材料0.5ml。
4．拔出针头，用石蜡封住穿刺孔。

3、鸡绒毛尿囊膜接种法
【方法】
1．取孵育9~12天的鸡胚，将气室及胎位画出。
2．在人工气室的位置，用碘酒消毒后，以小砂轮磨开一个三角形的窗口，只破掉蛋壳，但不伤卵膜，另在天然气室端的中央钻一小孔。用橡皮头自气室端小孔将气室中空气吸出使绒毛尿囊膜下陷与卵膜分离，而形成一人工气室。
3．在形成的人工气室处，将卵膜去掉，滴入牛痘苗病毒稀释液0.2ml，迅速将胶布封
于三角形卵窗上，以熔化石蜡封闭气孔。
4．接种后放入37℃温箱孵育，每日观察鸡胚生活情况，培养4~5日后放入冰箱，死亡的，随时发现随时放入冰箱。
5．将感染病毒的鸡胚自冰箱中取出，用碘酒、酒精消毒人工气室面，然后撕去胶布，将三角形窗口扩大，此时在明亮处可清楚的看到牛痘斑为白色的点状，有时融合成一堆或一片。
　　 6．左手用镊子镊起绒毛尿囊膜，右手用小剪在卵壳的圆周剪下绒毛尿囊膜，放入无菌生理盐水培养皿中洗涤2次，将膜张开，可更清楚地看到膜上的牛痘斑。
绒毛尿囊膜接种法适用于天花、牛痘、单纯疱疹等病毒的培养。

4、鸡胚羊水囊 （腔）接种法
【方法】
1．取孵育10~12天的鸡胚，将气室及胎位画出。
2．将鸡胚竖于卵架上，消毒气室部，用无菌钻子和镊子沿天然气室的边缘和胎位靠近处开一方形（每边lcm）小窗。
3．用无菌小镊子挑去方形卵膜，用无菌吸管吸取石蜡油滴入2滴，石蜡油在气室面的卵膜上很快散开，使膜透明化，这样在检卵灯下可清楚地观察到整个鸡胚。
4．用无菌lml注射器吸取0.2ml检材 (如流感病毒液)，针头自窗口对着鸡胚直下，穿过绒毛尿囊膜、羊水囊膜进入羊膜腔，注入检材0.2ml。注意穿刺注射时勿伤鸡胚本身。
5．接种完毕，用无菌胶布封口，鸡胚放于37℃培养48~72h。
接种也可以不用滴加石蜡油和在检卵灯下进行。用无菌的钝尖小镊子穿过绒毛尿囊膜，轻轻将羊水囊呈伞状提起，然后用注射器针头刺入，注入检材，封闭窗口。
6．接种后孵育期间，每日灯检，24h内死亡者为非特异性死亡，弃去；2~4天死亡者为特异性死亡，收获前放冰箱。
7．收获：从冰箱中取出鸡胚，碘酒消毒气室端，撕去胶布扩大窗口，用无菌镊撕去卵膜及绒毛尿囊膜，然后用毛细吸管吸去尿囊液，左手用镊子镊住羊膜腔，右手以毛细吸管插入羊膜腔吸取羊水。收获的羊水可测定病毒血凝效价及进行进一步的鉴定。
这种方法适于分离流感、腮腺炎等病毒。

                                                                  图10-1 鸡胚接种方法

二、 流感病毒的鉴定

【原理】
血球凝集试验（简称血凝试验）：流感病毒包膜上有两种刺突，化学成分为糖蛋白，其中一种称为血凝素（HA），另一种称为神经氨酸酶（NA）。多种动物（人、鸡、豚鼠）红细胞表面有HA的受体，流感病毒通过其表面的HA与红细胞表面的受体结合而引起红细胞凝集。该试验可用于流感病毒的鉴定。
【材料】
1． 病毒尿囊液、0.5%鸡红细胞悬液、生理盐水
2． 20孔U型塑料板、1ml吸管、橡皮吸头
【方法】
1．取一块洁净晾干的20孔U型塑料板，用标签纸作好标记，用吸管吸取生理盐水于10个孔内各加入0.2ml。在第一孔内加入已稀释成1：5的流感病毒尿囊液0.2ml,混匀后吸出0.2ml至第二孔，再混匀后吸0.2ml至第三孔，如此稀释至第9孔，于第9孔吸出0.2ml弃去，第10孔作对照，不加病毒尿囊液。
2．每孔加入0.5%鸡红细胞悬液和生理盐水各0.2ml，摇匀，置室温45min后观察结果。

【结果】
1． 实验现象观察：红细胞凝集程度
“++++”：红细胞均匀铺于孔底，致密呈团，边缘不整，呈锯齿状；
“+ + +”：基本同上，但较疏松，分布面积较大；
“+ +”：红细胞于孔底形成一个环状，四周有小凝集颗粒
“+”：红细胞于孔底形成小团，但边缘不光滑，四周有小凝集颗粒
“－”：不凝集红细胞沉于孔底形成一圆点，边缘整齐，如纽扣状
2． 结果判断：以出现 “++”凝集的最高病毒稀释度为凝集效价，亦即1个血凝单位。例如，1：320为+ +，即为1个血凝单位，在红细胞凝集抑制试验中需用4个单位病毒血凝集，按上例1个血凝单位为1：320，则1：80为4个血凝单位。
【注意事项】
1． 用反复吹吸法稀释混匀病毒或血清时，手法要轻、稳，尽量减少气泡出现。
2． 为了实验准确，加红细胞时，应从最后一孔起向前加。
3． 加样完毕，可将塑料板放光滑台面上慢慢划圈摇匀，但要防止溅出。
4． 观察结果时，塑料板底部垫上白纸，减少移动并按时观察。

三、流感病毒型别的鉴定

【原理】
流感病毒特异性抗体和相应病毒结合后可以抑制该病毒的血凝作用，称为血球凝集抑制试验，简称血抑试验。
应用型或亚型特异性抗体（免疫血清）与新分离的流感病毒株进行血凝抑制试验，可以鉴定流感病毒的型或亚型。
也可以用已知型或亚型的流感病毒与病人血清进行血抑试验作出血清学诊断，血清学诊断必须采取病人双份血清（急性期和恢复期）进行测定，恢复期血清效价比急性期增高4倍或4倍以上才有诊断意义。
【材料】
1． 流感病毒尿囊液（4个血凝单位）
2． 抗亚洲甲型日本亚型流感病毒免疫血清
3． 抗亚洲甲型香港亚型流感病毒免疫血清
4． 0.5%鸡红细胞悬液、生理盐水、20孔U型塑料板等
【方法】
1． 取干净20孔U型塑料板二块，用标签纸作好标记，于每板1~9孔内各加入生理盐水0.2ml。
2．于第一板第1孔和第8孔中各加入稀释成1：5的抗亚洲甲型日本亚型流感病毒免疫血清0.2ml，混匀后，从第1孔吸出0.2ml加入第2孔，按同法稀释至第7孔，从第7孔吸出0.2ml弃去（血清稀释度分别为1：10~1：640）。第二板按同法加入抗亚洲甲型香港亚型流感病毒免疫血清进行稀释。
3．于每板1~7孔和第9孔中，各加入4单位流感病毒血凝素0.2ml，第8孔不加流感病毒血凝素，作血清对照。
4．每板第10孔作为鸡红细胞对照孔加入生理盐水0.4ml。
5．摇匀，室温静置10min后，于二板各孔内分别加入0.5%鸡红细胞悬液0.2ml，摇匀,室温静置45min后观察结果，能完全抑制红细胞凝集的最高血清稀释度为血凝抑制效价。

【结果】
出现红细胞凝集完全被抑制的最高血清稀释度为红细胞凝集抑制效价。比较两块板的血凝抑制效价，对新分离的流感病毒型别作出鉴定。
【思考题】
1、血凝试验和血抑试验的原理。
2、流感病毒分型和甲型流感病毒亚型鉴别的依据是什么？
3、为何甲型流感病毒引起的流感易出现大流行？