酶校准品在血清酶测定结果标准化中的应用

北京医院卫生部临床检验中心  苏增留  张克坚  郭健  赵海舰

    血清酶水平对疾病的诊断具有重要意义。临床实验室中使用最广泛的测定方法是测定酶的催化活性，此方法具有快速，低成本等优点，但其最大的问题就是方法依赖性。由于目前酶的测定尚未建立标准体系，不同实验室间的测定结果差异仍然很大。为解决此问题，IFCC先后提出了两种解决方法：（1）推荐统一的测定方法；（2）用校准品对各测定系统进行统一校准。对于酶校准品的应用，目前仍有不同主张。赞同者认为校准品可以减少或消除因仪器、试剂等的不同所造成的偏差，最终使结果达到统一。反对者认为，厂家生产的仪器及其配套的试剂是一个完整系统，校准品的反应反而会破坏这种最佳组合状态，因此主张使用系统固定的K值。为了对此问题作进一步研究，我们分别用日立7170A与宝灵曼、科化、中生等3种试剂及贝克曼CX9全自动生化分析仪和其原装试剂构成4个“仪器/试剂”测定系统，测定了150份新鲜血清中的ALP、ALT、AST、LD、CK、GGT和100份ALP等6个酶学项目，对校准前后的测定结果进行了分析比较。
    材料和方法
    一、材料
    1．仪器  日立7170A全自动生化分析仪(日本)和贝克曼CX9全自动生化分析仪(美国)。
    2．试剂  （1）日立7170A与以下三个厂家的试剂分别组成三种“仪器/试剂”测定系统：德国宝灵曼公司产品，上海科华——东菱诊断用品有限公司产品，北京中生生物工程高技术公司产品。（2）贝克CX9使用贝克曼公司的原装试剂。（3）统一的校准品系日本旭化成药业株氏会社提供（批号：98060K）。
    二、方法
    1．校准前测定  （1）贝克曼“仪器/试剂”系统，使用厂家给定的K值；（2）日立/宝灵曼“仪器/试剂”系统：除LD使用理论K值外，其余几种酶均使用宝灵曼的校准品c.f.a.s（批号：19165401）来校准K值；（3）日立/中生和日立/科华“仪器/试剂”系统：试剂生产厂家给定的K值。
    每天测定10份新鲜血清样本，连续测15d （ALP测10d）。每份样本分别在4个测定系统上同时做双管测定。质控血清随机插入标本一起测定。
    2．校准后结果的计算  用统一的校准品对四个系统进行校准，分别得出一个校准K值。对同一个样本来说，一个有良好精密度的测定系统，其计算公式“C=△×K”中的“△A”在校准前后应是相同的，即使出现偏差，也是在系统本身的不精密度所造成的误差范围内（若出现失控，则当天的结果被抛弃）。通过以下计算公式，可得出校准后结果。
    150份（ALP 100份）新鲜血清样本校准前后结果均值的和CV值见表1。
 

表1 各系统校准前后测定结果均值s和CV值的比较

试剂	ALT		AST		CK		GGT		LD		ALP
	校前	校后	校前	校后	校前	校后	校前	校后	校前	校后	校前	校后
贝克曼 宝灵曼 科华 中生	41 49 40 35	42 43 41 43	36 39 31 31	37 35 33 35	107 107 92 101	110 117 110 117	60 78 57 54	73 81 82 79	159 180 169 152	194 206 205 199	83 129 76 80	270 288 300 259
S CV%	5.80 14.1	0.86 2.3	3.95 11.5	1.63 4.7	7.09 7.0	4.04 3.6	10.3 17.4	4.03 5.1	12.2 7.4	5.60 2.8	24.8 27.0	18.3 6.6

    由表1看出,用统一的校准品校准前，各系统同一项目测定结果的均值间存在一定的差异（CV值≥7.0%），尤其是ALP和GGT差异较大，分别为27.0%和17.4%。校准后差异明显降低，除ALP和GGT的CV值分别为6.6%和5.1%外，其余均<5%。
    讨    论
    我们选择了国内较常用的两种全自动生化分析仪日立7170A和贝克曼CX9。因为日立7170A为一开放系统，在此仪器上使用国产试剂的情况较为常见。因此，我们把两种国产试剂也列入了研究对象。4种试剂在测定的反应原理上和IFCC推荐方法一致，反应条件均在37℃。在校准前，测定结果间存在一定的差异，主要原因可能有两个：（1）即使反应原理相同，试剂生产厂家为了自动化分析的需要及其他生产过程中的原因，有意或无意地对推荐方法作了不同程度的改动，如反应时间，样本体积，缓冲液的浓度，离子强度，pH值等；（2）仪器间的差异。
    使用统一的酶校准品，如果影响酶反应的因素对校准品和病人标本的影响程度完全相同，校准品就会补偿由这些因素引起的变异，使方法间的一致性得到提高。校准品必须具备两个条件：（1）可溯源到国际标准；（2）较小的基质效应。目前，欧洲标准局和美国国家标准技术研究院（NIST）已经研制出了一些人血清基质的一级标准品（CRM），基质效应很小，但由于产量低，价格昂贵，只适合作为基准和研究使用。一些厂家已开发出了其值可溯源到一级标准品并适用于临床的校准品。其溯源关系如下：研制出基质效应较小，可溯源到一级标准品的主校准品（Master Calibrator），用手工方法为其定值，主校准品为商品化的用于常规实验室的工作校准品（Working Calibrator）定值，工作校准品为病人标本定值。
由于大批量生产和长期保存的需要，校准品在生产过程中可能会加入稳定剂等添加成分，或者有的校准品本身就是非人源性的物质，这样的校准品会有不同程度的基质效应（Matrix Effect）。一个厂家的标准品一般是在自己的测定系统内进行评价的，在其系统内，它能很好地把测定结果的值在参考方法常规方法间传递，但不一定适合另一个厂家的测定系统。因此，不要把一个厂家为其测定系统生产的校准品用来校准另外一个厂家的测定系统。作者认为，在实际工作中最好使用校准K值，因为校准品能对试剂、仪器及测定的全过程进行校准，而固定的K值却做不到。但必须注意校准品的质量，对其所要校准的测定系统来说，校准品的反应特性应该接近于人血清基质，即具有较小的基质效应。
    本研究所使用的校准品为日本旭化成药业株氏会提供，其值可溯源到日本临床化学会（JSCC）推出的酶参考物（ERM），用JSCC推荐方法以手工定值。该产品加入的酶除LD从人红细胞中提取外，其余均为基因工程产品，酶的性质接近于人血清中的酶。厂家宣称其产品在不同的测定系统上均表现出和人血清基质相同的特性，因此我们在研究中把它作为统一校准品。校准后的结果表明使用本文的酶校准品能使不同的测定系统间结果的差异降低。其中ALP因缓冲液的不同会给结果造成较大差异，JSCC推荐方法的缓冲液与IFCC推荐方法不同，前者比后者有更强的激活作用，因此，用JSCC推荐方法定值的校准品来校准测定系统后，ALP结果升高了3倍以上，但仍然可使结果间的差异明显减小。