宿主细胞残留 DNA 样本前处理试剂盒(磁珠法)手工提取操作方法

宿主细胞残留 DNA 样本前处理试剂盒(磁珠法)手工提取操作方法

1. 样本处理

1.1 待测样本为疫苗等本身含有较高的DNA含量的样本，可用1×PBS（pH7.4，无Ca和Mg）对样本进行适当比例稀释后提取（对样本进行稀释是为了保证检测的准确性，使样本的检测值在标准曲线线性范围之内，通常可考虑进行100倍稀释）。

1.2 待测样本为干粉的，可用超纯水将样本稀释成10 mg/mL或者100 mg/mL后使用。

1.3 待测样本为复杂背景基质的，可根据需要进行加标回收实验，以确定合适的样本稀释倍数。

2. 取100 μL样本装于1.5 mL离心管中，加入100 μL裂解液和10 μL蛋白酶K，涡旋混匀10 sec。

【注】：样本蛋白浓度0-100 mg/mL，蛋白酶K用量为10 μL；样本蛋白浓度100-200 mg/mL，蛋白酶K用量为20 μL。

3. 60℃孵育20 min。

4. 孵育完成后，加入400 μL结合液、9 μL糖原和6 μL Poly A钾盐涡旋混匀。  

5. 加入20 μL磁珠，涡旋混匀后，放置10 min，每隔3 min涡旋混匀10 sec。

【注】：磁珠使用前需涡旋混匀，保证磁珠彻底重悬。在一次性加样4-5次后，建议再次混匀后再行加样。

6. 短暂离心后，将离心管置于磁力架上静置1-2 min，待磁珠完全吸附，小心吸出液体。

7. 加入500 μL洗涤液A（使用前请先检查是否已加入无水乙醇），振荡或涡旋混匀，确保磁珠分散，离心管壁无聚集磁珠。

8. 短暂离心后，将离心管置于磁力架上静置1-2 min，待磁珠完全吸附，小心吸取液体。

9. 加入500 μL洗涤液B（使用前请先检查是否已加入无水乙醇），振荡或涡旋混匀，确保磁珠分散，离心管壁无聚集磁珠。

10. 短暂离心后，将离心管置于磁力架上静置1-2 min，待磁珠完全吸附，小心吸取液体。

11. 为保证尽量吸出残留液体，可将离心管快速离心10 sec后，置于磁力架上用10 μL移液器吸出残留液体。

12. 打开管盖，室温放置3 min直至乙醇完全挥发。观察到磁珠表面无反光或出现裂隙即表明乙醇已挥发完全。

13. 将离心管从磁力架上取下，加入50-100 μL 65℃预热的洗脱液，振荡混匀，短暂离心后，65℃孵育5 min，期间可振荡混匀1次。

14. 短暂离心后，将离心管放置于磁力架上静置2 min，待磁珠完全吸附，小心将DNA溶液转移至新的离心管中，保存于-20℃，长期保存需放置于-80℃。